빛 유도 청각 자극을 위한 마우스 등쪽 달팽이관 핵으로의 바이러스 매개 유전자 전달

초록

출처: Kozin, E. D., et.al. 청각 경로의 광유전학적 자극을 위한 쥐 등쪽 달팽이관 핵의 직접 시각화. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오는 빛 유도 청각 자극을 가능하게 하기 위해 마우스 등쪽 달팽이관 핵(DCN)으로의 바이러스 매개 유전자 전달을 보여줍니다. 빛에 민감한 이온 채널인 옵신을 암호화하는 바이러스 벡터는 직접 접근을 위해 개두술 및 소뇌 흡인 후 DCN에 주입됩니다. 발현된 옵신은 뉴런이 빛에 의해 활성화될 수 있도록 하여 광유전학을 사용하여 청각 경로 반응을 연구하기 위한 모델을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 소뇌 흡인

1. 5 프렌치 흡입을 사용하여 DCN이 시각적일 때까지 DCN 위에 있는 왼쪽 소뇌의 가장 측면 부분을 흡인합니다(그림 1, 오른쪽 패널). 왼쪽 소뇌의 약 1/4에서 1/3을 제거합니다. DCN에 인접한 주요 랜드마크는 상반고리관의 팽대부입니다.
   참고: 소뇌의 흡인은 프로토콜의 핵심 단계입니다. 소뇌의 지시 흡인은 출혈을 유발할 수 있으므로 여러 번의 흡입이 아닌 한 번의 시도로 발생할 때 가장 성공적으로 수행됩니다. 흡인을 돕기 위해 현미경의 초점면을 소뇌 표면에서 약간 원위에 있는 CN의 예상 깊이로 설정합니다. 초점면을 CN으로 설정하면 시각화가 향상되고 선명한 이미지가 보장됩니다.
2. 흡인 후 추가 출혈, 뇌척수액(CSF) 축적 및 DCN의 소뇌 변위가 예상됩니다. 혈액 응고를 방지하기 위해 0.5cc의 멸균 식염수를 개두술에 빠르게 주입합니다. 그런 다음 치과 지점으로 부드럽게 두드리고 흡입하는 것을 사용하여 DCN을 직접 시각화할 수 있는 경로를 비울 수 있습니다. DCN 표면에 직접 닿지 마십시오.

2. 바이러스 매개 유전자 전달 및 외과적 회복을 위한 압력 미세 주사

1. DCN에 위에 있는 혈액과 CSF가 없고 명확하게 보이면 2분 동안 10μl Hamilton 주사기를 사용하여 DCN에 압력 미세 주입을 합니다.
2. DCN 표면 아래에 팁이 더 이상 보이지 않을 때까지 마이크로 매니퓰레이터로 바늘을 삽입합니다.
3. 최적의 성능을 위해 33°와 같은 얕은 베벨이 있는 33 또는 34게이지 바늘(34게이지 바늘과 함께 기밀 주사기 사용)을 사용하여 둔기 외상을 최소화하고 얇고 얕은 뇌간 구조(<300μm 두께)인 DCN 내에서 주사량을 국소화합니다.
   참고: 다른 미세 주입 기구를 사용할 수 있습니다. 이상적으로는 주입 기기가 DCN을 직접 표적으로 삼는 데 필요한 경우 약간의 구부러짐을 허용할 수 있을 만큼 충분히 유연해야 합니다. 또한 호흡으로 인해 마우스가 절차 전반에 걸쳐 약간 움직이기 때문에 기구는 약간의 움직임을 견딜 수 있을 만큼 견고해야 합니다.

3. 외과적 회복

1. 주사 직후 피부를 다시 대략화하고 표준 회복 절차에 따라 마우스가 회복되도록 합니다. 남은 소뇌와 흉터 조직은 소뇌의 흡인으로 인한 공동을 채울 것입니다. 흉골 누운 자세를 유지하기 위해 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 지속적으로 모니터링하십시오. 심박수, 호흡수 및 수유 능력을 모니터링합니다.
   참고: 수술을 받은 동물은 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 우리로 되돌려 보내지 않습니다.
2. 쥐가 수술 후 원을 그리며 걷기 시작하면(사례의 <5%), 일반적으로 피부 절개 봉합 후 2-4시간 후에 마우스를 먹이는 데 어려움을 겪을 수 있으므로 즉시 마우스를 희생하십시오. 이 부작용은 소뇌의 흡인으로 인한 것일 수 있습니다. 수술 후 동물의 통증을 모니터링해야 하며, 제도적 기준에 따라 동물의 편안함을 보장하기 위해 적절한 마약을 투여해야 합니다. 감염의 증거가 있는 경우 항생제가 필요할 수 있습니다.

결과

그림 1: 부분 소뇌 흡인은 등쪽 달팽이관 핵에 대한 접근을 보여줍니다. 왼쪽 패널: 마우스를 홀더에 넣은 후 두개골의 후방을 따라 피부와 연조직을 통해 목의 연조직까지 수직으로 절개합니다. 피부가 측면화되고 관상 봉합선 위에 있는 근육이 제거됩니다. 중간 패널: 그런 다음 개두술은 뼈 rongeurs와 함께 소뇌 영역과 밑에 있는 등쪽 달팽이관 핵에 걸쳐 완료됩니다. 오른쪽 패널

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
정위 홀더	Stoelting	51500
5 프렌치 흡입	칭 외과 2777914
치과 포인트	Henry Schein	100-8170
뼈 rongeur	정밀 수술 도구	16020-14
10 μl 해밀턴 주사기	해밀턴	7633-01
34 게이지, 바늘	Hamilton	207434
Rongeurs	정밀 수술 도구	16021-14

대