동결 행동을 줄이기 위한 쥐 모델의 미주 신경 자극

초록

출처: Childs, J. E., et al. 소멸 학습과 관련된 경로에서 가소성을 유도하는 도구로서의 미주 신경 자극. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오는 동결 행동을 줄이기 위해 쥐 모델에서 미주 신경 자극(VNS) 방법을 보여줍니다. 공포에 걸린 쥐는 소리 재노출 중에 VNS를 받아 동결이 감소하고 치료 잠재력이 드러납니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 청각 공포 조건화

참고: 이 공포 조건화 프로토콜은 이러한 실험의 목표가 소멸을 강화하는 것이기 때문에 대부분의 것보다 더 집중적입니다. 쉽게 소멸되는 가벼운 공포 조건화로 바닥 효과가 이러한 향상을 모호하게 할 수 있습니다.

1. 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 12시간의 빛/암흑 주기 로 동물을 수용합니다. 수술 후 회복하는 동안 매일 동물을 만지십시오.
2. 소음 감쇠 챔버에 보관된 조작 상자로 구성된 컨디셔닝 및 테스트 장치를 설정합니다(그림 1C). 조작 상자에는 20 x 20 x 20cm의 투명한 플라스틱 벽이 있으며 발 충격 발생기에 연결된 스테인리스 스틸 그리드 바닥이 있습니다. 비디오 녹화를 위해 화이트 하우스 조명을 사용하여 챔버를 비춥니다. 9kHz, 85dB 음압 레벨(SPL) 톤을 조건부 자극(CS)으로 사용합니다.
3. 조작 상자 위의 챔버 내부에 있는 디지털 카메라를 사용하여 동작을 기록합니다. 동작실 외부에 있는 컴퓨터에서 세션을 보고 모니터링합니다. 나중에 분석할 수 있도록 비디오를 저장합니다.
4. 각 세션 전후에 70% 에탄올로 챔버를 닦아 후각 신호를 제거합니다.
5. 쥐를 2일 동안 공포 조건화합니다(그림 2A). 쥐가 첫날에 5개의 톤(9kHz, 85dB, 30초)을 제시하여 선천적으로 톤을 두려워하지 않는지 확인합니다. 동결 수준이 무시할 수 있는지 확인하십시오.
   연
   1. 속 2일 각각 8개의 톤-풋쇼크(1초, 0.5mA) 페어링으로 초기 톤 프레젠테이션을 따릅니다. 둘째 날에도 톤-풋쇼크 페어링을 다시 반복합니다. 자극 간 간격(ISI)을 2분에서 4분 사이로 변경하고 모든 시도에 대해 평균 3분을 사용합니다. 톤 중에 충격이 발생하는 지점을 무작위로 지정합니다.
6. 셋째 날에는 톤/충격 연관성의 강도를 테스트합니다. 발충격이 없는 상태에서 ISI가 3, 4 또는 5분(평균 4분)인 4개의 톤을 재생하고 조건부 공포 반응(CFR)의 척도로 톤 프레젠테이션 및 자극 간 간격 동안 동물의 동결 행동을 기록합니다.
7. 4일째에 미주 신경 자극(VNS) 또는 가짜 VNS로 소멸 훈련을 시작합니다.
   1. 자극기의 수 커넥터를 자극 입력 부위에 삽입하여 쥐를 자극기에 연결합니다. 동물을 챔버에 넣습니다(그림 1A, 1C). 자극기를 0.4Hz에서 500mA, 30μs 펄스 폭으로 설정합니다. 자극을 톤이 시작되기 150ms 전에 시작하여 총 지속 시간 30.15초로 설정합니다. 동물 놀이 4가지 톤을 플레이하고 각 톤 프레젠테이션을 VNS 또는 가짜 VNS와 페어링합니다.
8. 오실로스코프를 사용하여 커프와 입력 부위의 전기적 무결성을 주기적으로 테스트합니다.
   1. 동물을 정상적으로 연결하고 자극기에서 오실로스코프로 출력을 분할합니다.
   2. 오실로스코프의 범위를 -20V에서 +20V로 설정하고 자극을 실행합니다. 30Hz 자극의 파형은 오실로스코프에서 볼 수 있어야 합니다. 크기가 10V를 초과하는 자극은 높은 임피던스와 자극 입력 부위의 커프 또는 연결이 부적절하게 작동하고 있음을 나타냅니다.
9. VNS가 멸종 훈련에 미치는 영향을 테스트하려면 5일째에 두 번째 CFR 테스트를 실행합니다. 톤 프레젠테이션 중에 동결에 소요된 시간을 기록하고 이를 첫 번째 CFR 테스트 중에 기록된 기준선 동결과 비교합니다.
10. 치료 조건에 대해 눈이 먼 독립적인 관찰자를 사용하여 비디오를 분석합니다. 스톱워치를 사용하여 톤 프레젠테이션 중에 멈춘 시간을 측정합니다. 동결은 쥐가 빠른 호흡, 머리 숙임, 발 벌림을 보이는 완전한 부동성으로 정의됩니다. 동결 행동 분석은 톤 제시 중과 자극 간 간격의 두 단계로 나눌 수 있습니다.

결과

그림 1. 미주 신경 자극 및 실험 설정. (A) VNS에 사용되는 설정의 회로도. 동물은 2개의 백금-이리듐 와이어가 미주 신경을 감싸는 맞춤형 커프 전극으로 피하로 연결되는 헤드캡을 통해 자극 격리 장치에 연결됩니다. (B) 미주 신경 주위에 커프 전극을 배치합니다. 커프 전극을 봉합하기 전에 수술 절개 부위와 노출된 미주 신경의 현미경 사진. (C) 동물이 자극기에 연결된 청각 공포 조절에 사용되는 설정 사진.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Betadine	Henry Schein	69066950
디지털 카메라 - 로지텍 웹캠 C210	로지텍	B003LVZO88
플래티넘 이리듐 와이어	Medwire	10IR9/49T
절연 펄스 자극기 모델 2100	AM 시스템	720000
시노미터 10MHz 단일 채널 오실로스코프	시노미터	CQ5010C
Extech 407730 40-130데시벨 디지털 사운드 레벨 미터	Extech Instruments	B000EWY67W
DSCK-C 듀얼 출력, 스크램블 쇼커	Kinder Scientific Co