압착 부상 후 마우스의 좌골 신경의 축삭 재생

초록

출처: Li, Q., et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 압착 부상 후 마우스 좌골 신경의 축삭 재생 과정을 보여줍니다. 분리된 신경은 축삭 성장을 시각화하기 위해 뉴런에서 발현되는 형광 단백질과 함께 이미징을 위해 고정되고 준비됩니다. 낙산화형광 현미경을 사용하여 손상 부위에서 축삭 재생을 추적하여 재성장 정도를 평가합니다.

프로토콜

1. 재료 및 시약

1. 동물
   1. 실험을 위해 체중이 30-35g인 6주 된 암컷 CF1 마우스를 사용합니다.
      참고: 마우스는 1/4" 옥수수 속대 침구와 둥지를 틀기 위한 2" 정사각형 새끼가 있는 개별적으로 환기되는 멸균된 케이지에 그룹 사육(케이지당 5마리의 마우스)을 수용했습니다. 케이지는 제어된 12시간 명암 주기로 유지되었으며 실내 온도는 19.4°C에서 25°C 사이였습니다. 생쥐에게는 글로벌 설치류 사료와 자동 물 공급 시스템이
공급되었습니다.
2. Instruments
   1. 수술을 효율적으로 수행하려면 복강내 주사용 일회용 주사기(27G, 1.0mL), 모피 이발기, 실체 해부 현미경, 미세 수술 겸자, 미세 수술 가위, 작은 뼈 롱저 및 멸균된 부직포 스펀지.
      참고: 모든 기구와 재료는 수술 전에 고압멸균되거나 생산자가 사전 멸균합니다. 수술 중 기구에는 멸균 상태를 유지하기 위해 75% 알코올
이 분사됩니다.
3. 마취 용액
   마
   1. 취액 #1을 사용하여 마취를 유도하고 후근핵(DRG) 주사 전에 마취액 #2를 사용하여 마취를 유지합니다.
      1. 마취액 #1을 만들려면 케타민과 자일라진을 멸균 식염수에 최종 농도 10mg/mL 및 1.2mg/mL로 희석합니다.
      2. 마취액 #2를 만들려면 멸균 식염수에 아베르틴을 최종 농도 20mg/mL로 희석합니다.
4. DNA 플라스미드 및 RNA 올리고스
   1. 그에 따라 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 플라스미드를 준비합니다. 플라스미드 DNA를 멸균 탈이온수에서 2.0μg/μL의 농도로 희석합니다.
   2. Fast Green 염료 용액을 첨가하여 0.005–0.01%(v/v)의 최종 농도에 도달하면 주입 중 DRG 윤곽을 더 잘 시각화할 수 있습니다.
   3. 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA 올리고뉴클레오티드(마이크로RNA 올리고)를 제조업체에서 제공하는 해당 완충액에 용해시켜 최종 농도 50μM에 도달합니다.
5. Micro-Injection Pipette
   1. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 모세관 유리를 당기고 당긴 모세관 유리 피펫의 끝을 미세수술 가위로 잘라 외경이 약 50μm인 구멍을 만듭니다. 그런 다음 깨끗한 벤치에서 자외선 아래에서 약 20-30분 동안 유리 피펫을 멸균합니다.
   2. 멸균된 유리 피펫을 세포내 미세 주입 디스펜스 시스템에 연결된 피펫 홀더에 장착합니다. 마이크로 주입 시스템의 매개변수를 30psi의 압력과 8ms의 지속 시간으로 설정합니다.
6. Electroporation System
   1. 전극을 구형파 전기천공 시스템에 연결하고 다음 매개변수를 설정합니다: 생체 내 전기천공을 위해 950ms 간격으로 35V에서 15ms 펄스
.
7. 관류 및 고정 용액
   1. 파라포름알데히드(PFA) 분말을 4%(w/v) 농도의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시킵니다. PFA 용액을 4°C에서 보관합니다.

2. 실험 절차

1. L4 및 L5 DRG의 외과적 노출
   1. 이전에 준비된 마취액 #1의 복강내 주사를 사용하여 마우스를 마취합니다(케타민 100mg/kg 체중 및 자일라진 12mg/kg 체중).
   2. 모피 가위로 수술 부위를 면도하십시오.
      참고: 왼쪽 좌골 신경 압착에 대한 또 다른 수술이 있기 때문에 왼쪽 허벅지 뒤쪽의 털을 동시에 면도할 수 있습니다.
   3. 가열된 담요(35.0°C) 위에 마우스를 놓고 온도 프로브로 직장 온도를 모니터링합니다.
   4. 마취를 테스트하려면 마우스의 발가락과 꼬리를 꼬집고 행동 반응을 관찰합니다.
   코
   5. 르크판에 쥐의 네 팔다리를 테이프로 붙입니다.
   6. 요오도포어 용액으로 수술 부위를 닦은 후 피부를 절단하기 전에 75% 알코올을 사용하여 요오도포를 제거합니다.
   마
   7. 취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 눈에 안용 연고를 바르십시오.
   8. 절개하기 전에 장골능의 양쪽을 가는 마커 펜으로 표시하십시오. L5 DRG의 위치를 쉽게 식별할 수 있도록 장골능의 두 지점을 연결하는 선을 그립니다.
   9. 미세가위로 허리 정중선을 따라 3cm 절개합니다. 또한, 다열근, 요장근 등 극주위근을 L3에서 S1 극돌기까지 분리하고, L4-5와 L5-6의 후관절을 노출
   시킨다.
   10. 마이크로 롱저를 사용하여 L4-5 및 L5-6의 패싯 조인트를 제거합니다. 또한 L4와 L5의 왼쪽 신경궁을 제거하여 DRG의 등쪽을 노출시킵니다.
2. DRG 주사
   1. DRG 주사 전에 마취 유지를 위해 마취액 #2(아베르틴 200mg/kg 체중 포함)를 복강 내 주입합니다.
   2. DNA 플라스미드 또는 RNA 올리고(DRG당 1μL)를 유리 모세관 피펫에 로드합니다.
   3. 모세관 유리 피펫의 끝을 DRG에 조심스럽게 삽입합니다.
   4. 세포내 미세주입 디스펜스 시스템(30psi, 8ms)을 사용하여 DNA 플라스미드 또는 RNA 올리고 용액 1.0μL를 DRG에 점차적으로 주입합니다.
      참고: 주사 시간은 5분 이상 지속되어야 합니다.
3. Electroporation
   1. 전극 끝에 PBS를 떨어뜨립니다.
   2. 멸균된 사각 면 거즈로 출혈을 청소하십시오.
   3. 전극으로 대상 DRG를 부드럽게 꼬집고 전기천공 시스템으로 5개의 정사각형 전기 펄스를 적용합니다.
   4. 근육층과 피부층을 각각 5-0 나일론 봉합사로 봉합합니다.
   5. 마우스가 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 세심한 주의를 기울여 가열된 담요(35.0°C) 위에 마우스를 놓습니다. 마우스가 마취에서 완전히 회복된 후 홈 케이지로 되돌립니다.
      참고: 마우스가 37°C 담요에서 마취에서 완전히 회복되는 데 약 60분이 걸립니다. 이부프로펜 1알(200mg)을 물 1,000ml(0.2mg/ml)에 녹여 매일 수유하여 수술 후 통증을 완화합니다.
4. 좌골 신경 압착
   1. DRG 전기천공 후 2일 또는 3일(실험 설계에 따라 다름) 마취액 #2(아버틴 400mg/kg 체중 포함)로 마우스를 복강 내 마취합니다.
   코
   2. 르크판에 쥐의 네 팔다리를 테이프로 붙입니다.
   3. 정중선을 따라 왼쪽으로 1cm 0.5cm 절개합니다. 대둔근과 이상근과 같은 근육을 세로로 자릅니다. 대좌골공과 좌골 노치 사이의 좌골 신경 부분을 노출시킵니다.
   4. 미세수술 겸자로 12초 동안 신경을 분쇄하고 10-0 나일론 신경상막 봉합사로 압착 부위를 표시합니다. 경막막에 매듭을 만들어 압착 부위를 표시합니다.
   5. 5-0 나일론 봉합사로 근육과 피부층을 봉합합니다.
   6. 쥐가 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 완전히 회복할 때까지 세심한 주의를 기울여 가열된 담요(35.0°C) 위에 마우스를 놓습니다. 마취에서 완전히 회복된 후 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
      참고: 마우스가 37°C 담요에서 마취에서 완전히 회복되는 데 약 60분이 걸립니다. 이부프로펜 1알(200mg)을 물 1,000ml(0.2mg/ml)에 녹여 매일 수유하여 수술 후 통증을 완화합니다.
5. 마우스 관류, DRG 및 좌골 신경 수확
   1. 좌골 신경 압착 2-3일 후(실험 설계에 따라 다름) 마취액 #2로 마우스를 복강 내 마취합니다.
   2. PBS(pH 7.4)로 마우스를 경심적으로 관류한 다음 PBS에서 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)(pH 7.5)를
   관류합니다.
   3. 관류 후 해부 현미경 아래에서 미세 가위와 미세 겸자를 사용하여 무릎 앞의 신경근 및 좌골 신경과 함께 DRG를 조심스럽게 분리합니다. 좌골 신경을 4°C에서 밤새 4% PFA에 직접 넣습니다.
6. 형광 표지 감각 축삭 이미징 및 측정
   해
   1. 부 현미경 아래에서 미세 가위와 미세 겸자로 고정된 좌골 신경에 부착된 조직과 막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 4% PFA를 PBS로 교환하고 신경을 세 번 세척합니다.
   2. 좌골 신경을 슬라이드 위에 놓고 똑바로 유지합니다. 신경 주위에 80μL의 퇴색 방지 용액을 첨가한 다음 그 위에 커버슬립을 놓습니다. 장착된 전체 조직을 압력으로 평평하게 만듭니다.
   3. 모자이크 획득 및 이미지 처리를 위한 액세서리가 장착된 도립 낙광 현미경에 평평한 조직을 놓습니다.
      참고: 여기 및 방출 길이는 488nm 및 509nm입니다. 여러 겹치는 이미지를 수동으로 촬영하고 Mosaic 플러그인과 함께 ImageJ를 사용하여 이미지를 연결하는 것도 가능합니다.
   4. 재생된 축삭의 길이를 측정할 때 좌골 신경에서 식별 가능한 모든 형광 표지 축삭을 압착 부위(10-0 신경외 봉합사로 표시됨)에서 원위 축삭 말단까지 추적합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ECM 830 구형파 전기천공 시스템	BTX Harvard Apparatus	45-0052	생체 내 전기천공용
Tweezertrodes 전극	BTX Harvard Apparatus	45-0524	체 내 전기천공용, 1mm 평면
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	세포내 미세 주입 디스펜스 시스템
유리 모세관 풀러	NARISHIGE	PC-10
붕규산 유리 모세관	World Precision Instruments, Inc.	1902328
실체 해부 현미경	라이카	M80
미세수술 Rongeur	FST	16221-14
미세수술 겸자	FST by DUMONT, 스위스	11255-20	좌골 신경 압착 전용
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, 표준 벽
테이프	Fisherbrand	15-901-30	코르크 보드에 마우스 고정용
2, 2, 2-트리브로모에탄올(Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin 원액
2-메틸-2-부탄올	Sigma-Aldrich	152463	Avertin 원액
siRNA 형광 범용 음성 대조군 #1	Sigma-Aldrich	SIC003	를 사용한 비표적 siRNA
Dy547을 사용한 형질감염 모방 대조	Dharmacon	CP-004500-01-05	사용한 비표적 microRNA
	Invitrogen Purelink	K210016	GFP 코딩 플라스미드 준비
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	주입 중 DRG 윤곽을 더 잘 시각화하기 위해
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	마취 유도
자일라진	AnaSed	NDC 59399-110-20	마취 유도
아세트아미노펜	McNeil 소비자 건강 관리	NDC 50580-449-36	수술 후 통증 완화

생 형광 microRNA 형광 플라스미드 준비 키트를