외상성 뇌손상이 있는 마우스에 신경 세포 현탁액의 정위 이식

초록

출처: Furmanski, O., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료적 이식을 통한 마우스 뇌 손상의 제어된 피질 충격 모델. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오에서는 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포를 심부 피질의 회백질-백질 경계에 입위적으로 주입합니다. 이식된 세포는 조직에 통합되어 손상된 뇌의 기능 회복과 회로 복구를 촉진합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 세포 현탁액의 정위 이식

두

1. 개골 절제술 후 약 24시간 후에 세포 이식 절차를 시작합니다.
2. 세포 이식 장비 및 수술 용품을 준비합니다
   1. 상처 세척을 위해 1mL 슬립 팁 주사기에 멸균 식염수를 채웁니다. 관개를 제어하기 위해 주사기에 25G 바늘을 부착합니다.
   2. 면역 억제를 위해 1mL 슬립 팁 주사기에 CsA(사이클로스포린 A) 용액을 채웁니다. CsA 주사기에 25G 이상의 바늘을 부착합니다. 수술 사이에 필요에 따라 CsA 주사기를 리필하십시오.
   3. 표준 방법을 사용하여 1.0mm OD(외경) 붕규산 유리 모세관 피펫에서 유리 바늘을 준비합니다.
   4. 가는 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 약 200μm 직경으로 부릅니다. 바늘의 원통형 샤프트가 2.5cm를 넘지 않는지 확인하십시오.
3. 10μL 주사기와 함께 사용할 수 있도록 주사기 펌프를 보정합니다. 0.2 μL/min의 유속을 입력하면 총 부피가 2.0 μL입니다.
4. 인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 현탁액을 준비합니다.
   1. 표준 멸균 취급 기술을 사용하여 세포 배양 BSL-2(생물안전성 레벨-2) 후드에서 모든 세포 취급을 수행합니다.
   2. 세포 유형에 대해 정의된 표준 조건에 따라 미리 세포 배양을 준비하십시오.
      참고: 이 시연에 표시된 실험은 hiPSC에서 파생된 다양한 신경 표현형 세포를 사용했습니다.
   3. 세포 박리 용액 또는 기타 바람직한 효소 또는 화학적 수단을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리시킵니다.
   현
   4. 탁액의 세포를 계수한 다음 1.7mL 플립탑 시험관에서 최소 세포 배양 배지(예: DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium))에서 현탁액을 5 x 10⁴ 세포/μL로 희석합니다.
   5. 이식에 대한 다음 참고 사항을 준수하십시오.
      1. 시술 기간 동안 세포를 37°C에서 현탁 상태로 유지합니다.
      2. 실질내 주사를 수행하기 직전에만 주사기를 로드하십시오
         참고: 세포 현탁액을 옆으로 눕히면 중력으로 인해 주사기 측면에 가라앉거나 달라붙어 주입되는 세포 수가 불규칙해질 수 있습니다.
      하루
      3. 에 여러 세포 이식 절차를 수행하는 경우 마우스당 ~5 x 10⁵ 세포(10 μL 현탁액)를 할당합니다.
5. 정위 이식 수술을 수행합니다
   1. 압축 산소 공급원이 있는 이소플루란 기화기에 연결된 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. ~0.7 L/min 산소에서 ~3% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
   마
   2. 취제 노즈콘이 부착된 정위 프레임에 마우스를 놓습니다.
      1. 이어바와 바이트 바로 머리를 제자리에 고정하고 두개골 전두골이 수평이 되도록 머리의 방향을 잡습니다. 수술 기간 동안 1.5%-2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
   3. 수술 전 관리 및 무균 준비를 수행합니다
      면
      1. 봉을 사용하여 항생제가 함유된 수분 공급 안과 연고를 눈에 바릅니다.
      2. 절개 부위를 멸균 식염수로 세척하여 해당 부위를 청소하고 봉합사를 풉니다. 면봉으로 70% 에탄올을 부드럽게 도포하여 절개 부위를 살균합니다.
   4. 가는 핀셋과 안과용 가위를 사용하여 봉합사를 제거합니다. 풍부한 멸균 식염수로 수술 부위와 두개골 절제술을 세척합니다.
      1. 피질이 과도한 탈출, 변색, 혈관 형성 장애 또는 출혈과 같은 부적격 특성을 나타내는 경우 동물을 제외해야 합니다.
   5. 세포 이식 주사기를 로드합니다
      1. 세포 현탁액을 37°C 인큐베이터에서 세포 배양 생물안전 후드로 옮깁니다. 균질한 세포 현탁액을 보장하기 위해 튜브를 부드럽게 휘젓거나 두드립니다.
      2. 마이크로 피펫터를 사용하여 플런저 끝을 통해 ~7.5 μL 세포 현탁액을 Hamilton 주사기에 로드합니다.
         1. 플런저 끝이 아래를 향하도록 주사기를 ~120° 각도로 잡습니다. 서스펜션과 플런저 팁 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 플런저를 삽입합니다.
      3. 개스킷 어셈블리를 피펫 바늘에 부착한 다음 바늘을 주사기에 부착합니다.
      4. 플런저를 눌러 세포 현탁액을 피펫 바늘로 옮깁니다. 현탁액 유출에 대한 저항이 있는 경우 가는 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨려 직경을 확대합니다.
   주
   6. 사기를 정위 주사기 펌프에 부착합니다. 플런저를 전진시켜 주사기 펌프 어셈블리가 제대로 작동하는지 확인하십시오.
   7. 바늘을 주입할 좌표로 이동합니다.
      바
      1. 늘 끝을 bregma에 맞춥니다. X 및 Y 좌표를 0으로 설정합니다. 그런 다음 바늘 끝을 두개골 절제술 위로 측면 2.0mm, 후방 -1.0mm로 이동합니다. 바늘 끝을 경막 표면에 대고 정위 좌표를 Z = 0으로 설정합니다.
      바
      2. 늘을 뇌에 삽입하기 전에 플런저를 눌러 세포 현탁액이 적절하게 흐르는지 확인하십시오.
      3. 바늘을 Z = -1.4mm 깊이로 뇌에 삽입합니다. 이러한 정위 좌표는 심부 피질의 회백질-백질 경계에 이식편을 배치합니다.
   8. 주사기 펌프를 시작하여 세포 현탁액을 주입합니다. 실험실 벤치 타이머를 15분으로 설정하고 타이머를 시작합니다. 장거리 현미경을 사용하여 세포 현탁액 유출을 모니터링합니다.
      1. 조직 수화를 유지하기 위해 주사 중에 멸균 식염수로 수술 부위를 세척합니다.
      2. 15분에 이식 바늘을 천천히 빼냅니다. 수술 부위에 식염수를 세척하고 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다.
   9. 수술 후 관리를 수행합니다
      마
      1. 취를 중단하십시오. 10mg/kg 용량으로 목덜미에 피하 주사하여 CsA를 전달합니다. 쥐를 깨끗하고 예열된 수술 후 케이지에 넣습니다.
      식
      2. 수에 아세트아미노펜 진통제를 1.0mg/mL로 제공합니다.
         참고: 적절한 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 표준 운영 프로토콜(SOP)에 따라 실험 결과 변수를 고려하여 진통제를 제공합니다.
      수
      3. 분 보충과 회복을 돕기 위해 축축한 차우 사료 회수 케이지를 제공하십시오.
6. 마우스의 생존 기간 동안 매일 10mg/kg의 CsA 주사를 계속합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1ml 주사기	Becton Dickinson(BD)	309659
1.7ml 플립탑 시험관	Denville	C2170
10마이크로리터 주사기	해밀턴	7635-01
25G 정밀 글라이드 주사기 바늘	벡톤 디킨슨(BD)	305122
70% 에탄올			선택 제품; 지역에 따라 다름
아세트아미노펜 경구 현탁	타이레놀(어린이용)		물에서 1mg/ml로 희석
마취 기화기	Vetland	0521-11-22
동물 취급 천			백화점에서 구매
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
압축 산소			선택 제품; 지역에 따라 다름
사이클로스포린 A	시그마-알드리치	30024-100mg
디메틸 설폭사이드(DMSO)	시그마-알드리치	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
전기 테이프	3M Corporation		백화점에서 구매
고급 핀셋	Fine Science Tools	11254-20
겸자	Fine Science Tools	91106-12
유리 모세관 피펫, 1mm OD, 0.58mm ID	World Precision Instruments	1B100F-3
고속 로터리 마이크로모터 키트	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
이상적인 마이크로 드릴 버 세트 5	셀 포인트 사이언티픽	60-1000
임팩트 1 CCI	카 바이오시스템	39463920
이소플루란	박스터	NDC-10019-360-60
실험실 벤치 타이머	피셔 사이언티픽	14-649-17
마이크로피펫 풀러	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	모든 풀러로 충분합니다
현미경 커버 슬립	피셔 브랜드	12-545-E
현미경 슬라이드 장착 매체			선택 제품
거울			화점에서 구매
바늘 홀더 지혈제	정밀 과학 도구	12002-12
안과 연고	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
안과용 스프링 가위	Fine Science Tools	15018-10
플라스틱 상자			화점에서 구매
플라스틱 실린더			화점에서 구매
QSI 전동 주사기 펌프	Stoelting	53311
탈착식 바늘 압축 피팅	Hamilton	55750-01
소형 설치류 정위 프레임	Stoelting	51925
소형 가위	Fine Science Tools	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
멸균 알코올 준비 패드	Fisherbrand	06-669-62
멸균 면봉/Kendall 면봉 Tyco	Healthcare	540500
멸균 식염수	Hospira	NDC-0409-1966-07
스톱워치 (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold 현미경 슬라이드	Fisherbrand	15-188-48
봉합사 - 곡선 바늘이 있는 5.0 실크	오아시스	MV-682

액 라이용 1 정위 임팩터 백 백 백