알파-시누클레인 발현의 후생유전학적 조절을 위한 신경 전구 세포의 렌티바이러스 형질도입

초록

출처: Tagliafierro, L., et al. 후성유전체 편집 도구를 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델에 효율적으로 전달하기 위한 렌티바이러스 벡터 플랫폼. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 파킨슨병의 핵심 단백질인 알파-시누클레인의 표적 후생유전학적 변형을 위한 신경 전구 세포(NPC)의 렌티바이러스 형질도입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 메틸트랜스퍼라제 매개 DNA 메틸화를 가능하게 하여 유전자 조절 및 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위해 SNCA 발현을 감소시킵니다.

프로토콜

1. 도파민성 신경 전구 세포의 분화

1. MD NPC(중뇌 도파민성 신경 전구 세포)
   1. BMM(염기성 매트릭스 멤브레인) 코팅 플레이트를 준비하고 완전한 N2B27을 따뜻하게 합니다. 10mL의 따뜻한 DMEM/F12를 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 냉동 세포를 37°C 열 블록에 2분 동안 넣습니다.
      1. 세포를 극저온 장치에서 DMEM/F12가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
      2. 상청액을 흡인하고 세포를 2mL의 N2B27에 재현탁한 다음 세포 현탁액을 BMM 코팅 플레이트의 한 웰에 첨가합니다. 세포를 37°C에서 5% CO₂와 함께 배양합니다.

2. MD NPC의 형질도입 및 메틸화 변화 분석

1. MD NPC의 형질도입
   1. MOI(감염 다중도) = 2에서 LV(렌티바이러스 벡터)-가이드 RNA/비활성화된 Cas9-DNMT3A(DNA 메틸트랜스퍼라제 효소 3A) 벡터와 70% 합류하여 MD NPC를 형질도입합니다. 형질도입 후 16시간 후에 N2B27 배지를 교체합니다.
   2. 형질도입 후 48시간 후에 N2B27을 5μg/mL 퓨로마이신과 함께 첨가합니다. 안정적인 MD NPC 라인을 얻기 위해 N2B27과 퓨로마이신에서 3주 동안 세포를 배양합니다. 세포는 다운스트림 응용 분야(DNA, RNA, 단백질 분석, 표현형 특성화, 동결 및 계대)에 사용할 준비가 되어 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장비
15mL 원추형 원심분리기 튜브 Corning		430791
6웰 플레이트	Corning	3516
Allegra 25R 탁상용 원심분리기	Beckman Coulter	369434
도립 형광 현미경	라이카	DM IRB2
세포 배양 시약 항
생제-항진균 용액, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 보충제(50X), 비타민 A 마이너스	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 보충제(100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal 배지	Thermo Fisher Scientific	21103049