마우스의 자궁 내 바이러스 형질도입

초록

출처: Lutz, D., et al. 발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 형질도입 후 초미세구조 신경가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 마우스 배아에서 자궁 내 주사를 통한 바이러스 형질도입을 보여줍니다. 임신한 쥐를 수술을 위해 준비하고 정중선 절개를 하여 자궁 뿔을 노출시킵니다. 원하는 유전자를 포함하는 바이러스와 추적 염료의 혼합물을 표적 위치의 자궁 주머니 내의 배아에 주입합니다. 그런 다음 봉합하기 전에 자궁 뿔을 다시 배치합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 자궁 내 형질도입

1. : pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)에서 원하는 표적(4 x 10,¹¹ 바이러스 입자/AAV1 μL)을 암호화하는 아데노 관련 바이러스 1형(AAV1)을 준비합니다. 0.1 mg/μL Fast Green을 첨가하고 AAV1-Fast-Green 혼합물을 37°C로 유지합니다.
2. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 원하는 모양(길이 8mm, 외경 80μm, 내경 50μm)의 얇은 모세관 팁을 준비합니다(설정: 압력 = 500, 열 = 700, 당김 = 0, 속도 = 80, 시간 = 200, 재료 표 참조). 모세관의 끝을 4-5mm가 되도록 부수십시오.
3. 모세관 끝이 있는 흡인 튜브(44cm x 0.7cm)를 조립하고 AAV1-Fast-Green 혼합물 15μL를 모세관으로 흡인합니다.
4. 전체 절차 동안 동물 피험자를 37°C의 일정한 생리학적 체온으로 유지하십시오.
5. 임신한 C57Bl/6 마우스(배아 14.5일)를 사전 배양 챔버에 넣고 기체 4% 이소플루란(0.6-0.8L/min의 체적 기류량)으로 마우스를 마취합니다.
6. 피하 부프레노르핀(0.1mg/체중 kg)을 주사합니다.
7. 마취된 마우스를 예열된 수술용 플레이트(37°C)에 놓습니다.
8. 윤활제로 눈을 덮으십시오.
마
9. 취 마스크(0.6-0.8 L/min의 체적 기류 속도에서 기체 1.5% 이소플루란)를 마우스를 수술용 플레이트에 끼우고 복부 피부 부위를 면도합니다. 면도된 부위를 3X 75% 에탄올로 닦은 다음 베타딘 용액으로 닦습니다.
   참고: 마취된 마우스의 호흡 행동을 지속적으로 모니터링합니다. 마우스의 흡-호기 패턴에 따라 이소플루란 가스의 농도를 조정합니다.
10. 마우스의 뒷발 지골을 쥐어짜서 족저반사가 없는지 확인합니다.
11. 구부러진 톱니 모양의 홍채 집게(10cm)로 피부를 잡고 직선 텅스텐 카바이드 가위(10cm)로 정중선을 따라 피부를 자른 다음 직선 Dumont 핀셋(12cm, 0.2mm x 0.12mm)으로 복막벽을 잡고 직선 Vanna 가위(8cm)로 백선을 따라 벽을 자릅니다.
12. 복부 개구부에 천공 파라핀 필름 조각을 놓고 미세 모기 지혈 겸자(12.5cm, 곡선)로 양쪽 끝에 필름을 고정합니다.
13. 자궁 뿔 내부의 배아가 손상되지 않도록 숟가락 모양의 장치로 자궁 뿔을 노출시킵니다. 자궁 뿔에 PBS(37°C) 몇 방울을 떨어뜨리고 자궁낭 내부의 손상이나 기형이 있는지 배아를 검사합니다.
14. 자궁 뿔에 있는 배아의 순서와 위치를 문서화하십시오. 원하는 주사 위치에 도달할 때까지 자궁낭 내부에서 배아를 조심스럽게 돌립니다.
입
15. 체 현미경으로 주사 부위(예: 뇌실)와 염료 침투를 육안으로 검사하여 AAV1-Fast-Green 혼합물 1-2μL를 주입합니다.
16. 주입된 배아를 문서화하고 주입된 배아와 함께 자궁 뿔을 다시 복강에 넣습니다.
17. PBS(37°C) 몇 방울을 복강에 떨어뜨립니다. Halsted의 모기 지혈 겸자(12.5cm, 곡선)를 사용하여 복막벽(폴리아미드 6-0 크기 봉합사 사용)과 피부(폴리아미드 3-0 크기 봉합사 사용)를 봉합하여 구멍을 닫습니다. 또는 간단한 단속 패턴 또는 스테인리스 스틸 봉합사/스테이플을 사용하여 복강과 피부를 봉합합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
26Gx 1'' 바늘	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 공기 펌프용 마취 장치	Biomedical Instruments(Univentor)	8323102
아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1)	UKE(바이러스 핵심 시설)	-	AAV1의 참조 및 표적 영역은 https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ 및 다음을 참조하십시오: 디자이너 유전자 전달 벡터: 향상된 유전자 전달을 위한 분자 공학 및 아데노 관련 바이러스 벡터의 진화. 권이, 샤퍼 DV. Pharm Res. 2008년 3월; 25(3):489-99. 혈청형 1, 2 및 5의 바이러스 캡시드로 유사형화된 재조합 AAV 바이러스 벡터는 중추신경계의 다른 영역으로 전달된 후 차등 효율과 세포 친화성을 나타냅니다. 버거 C, 고르바추크 OS, 벨라르도 MJ, 페덴 CS, 윌리엄스 P, 졸로투킨 S, 라이어 PJ, 만델 RJ, 무지츠카 N. 몰. 더. 2004년 8월; 10(2):302-17. 자기 상보적 재조합 아데노 관련 바이러스(scAAV) 벡터는 DNA 합성과 독립적으로 효율적인 형질도입을 촉진합니다. 맥카티 DM, 모나한 PE, 사물스키 RJ. 진 더. 2001년 8월; 8(16):1248-54.
공기 펌프	생체 의학 기기 (Univentor)	Eheim 100
흡인기 튜닝 어셈블리	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
호흡 마스크 마우스 양극 산화 알루미늄	생체 의학 기기 (Univentor)	-
부프레노르핀	템 게식	앰플 진	통제
모세혈관	과학 제품	GB100TF-10	충전재 포함
Dumont 핀셋(#3, 12cm, 직선, 0.2 x 0.12mm)	FST	11203-23
전기 면도기	Phillips	-
Ethicon 봉합사(Ethilon, 6-0 및 3-0)	Ethicon	-	폴리아미드
눈 윤활제	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	주입된 액체의 시각화용
가스 라우팅 스위치 4/2 커넥터	Biomedical Instruments(Univentor)	8433020
Halsted Mosquito 지혈 겸자(12.5cm, 직선)	FST	13011-12
수평으로 움직이는 뚜껑이 있는 마우스용 인덕션 박스.내부 치수: LxBxH: 155x115x130mm.벽 두께: 6mm	Biomedical Instruments(Univentor)	-
홍채 집게(10cm, 곡선, 톱니 모양)	FST	14007-14
홍채 가위(11cm, 직선, 텅스텐 카바이드)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, 전기 가열, sm외부 치수: 257x110x18mm.가열 영역: 190x90mm호흡 마스크를 빠져나가는 이소플루란의 제거는 규정에 따라 아래			쪽으로 이루어집니다.
이소플루란(Attane)	JD 의료용		흡입 마취
광학 현미경 기본 DM E	Leica-4x		(N.A. 0.1 ∞/-), 10x(N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x(N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x(N.A. 1.25 ∞/0.17) 대물렌즈
마이크로피펫 풀	Science-Products	P-97
모기 지혈 겸자(12.5cm, 곡선)	FST	13010-12
Thermopuller P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 모든 부품 연결용 튜브 재질외경: 6mm내경: 4mm벽 두께: 1mm	Biomedical Instruments(Univentor)
Vannas 가위(8cm, 직선)	FST	15009-08