뇌졸중 후 마우스 모델에 하이드로겔의 정위 주입

초록

출처: Wilson, KL, et al. 뇌졸중 후 뇌에 하이드로겔 생체 재료 스캐폴드 주입. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 뇌졸중 후 마우스의 뇌졸중 코어에 하이드로겔을 정위 주입하는 방법을 보여주며, 세포외 기질을 모방하고 세포 침윤을 촉진하며 혈관신생을 지원하는 스캐폴드 형성에서의 역할을 강조하여 뇌졸중 회복에 있어 신경치료 잠재력을 강조합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

하이드로겔 또는 기타 생체재료 주입

1. 사용자가 정의한 시간에 생체재료 주입을 수행합니다. 이 실험에서는 뇌졸중 후 5일에서 7일 사이에 주사를 수행했습니다. 2 - 6 μL의 하이드로겔을 주입합니다.
   마
   1. 취 중 마우스의 체온(37°C)을 유지하려면 가열 패드를 켭니다.
   2. 고압멸균 가위, 겸자, 면, 수의사 눈 연고, 수술용 접착제 또는 봉합사 재료, 멸균 알코올 및 베타 요오드 물티슈를 준비합니다. 멸균 드릴 비트 헤드가 있는 뼈 드릴과 금속 30G 바늘이 있는 25μL 유리 해밀턴 주사기를 준비합니다.
   비
   3. 드 멸균을 160°C로 켜서 마우스 간에 기구를 멸균할 수 있습니다.
   4. 주입 펌프를 정위 고정 장치에 부착합니다. 유속을 1 μL/min으로 설정하고 부피를 4 μL로 설정합니다.
   5. 수술 후 쥐를 위한 깨끗한 케이지를 준비하십시오.
2. 마우스를 이소플루란 농도 4%의 유도 챔버에 넣어 자발적인 움직임이 멈추고 호흡이 느리고 일정한 속도가 될 때까지 마취합니다.
   1. 잠든 후 마우스를 1.5%의 유지 이소플루란 농도로 정위 장치에 옮기고 고정합니다.
   2. 수의사 눈 연고를 양쪽 눈에 바릅니다.
   3. 쥐의 머리에서 다시 자랐을 수 있는 털을 면도하고 알코올 물티슈를 사용한 다음 베타 요오드 물티슈를 사용하여 해당 부위를 무균 상태로 준비합니다. 세 번 반복합니다.
      참고: 필요한 경우 마지막에 여분의 알코올 물티슈를 사용하여 베타 요오드를 모두 제거하십시오.
3. 작은 가위 및/또는 집게를 사용하여 뇌 위의 피부를 다시 엽니다. 멸균 식염수 또는 PBS(인산염 완충 식염수)와 함께 면을 사용하여 두개골의 잔해물을 청소하십시오. 흰색-노란색 원(스트로크, 그림 1B)과 드릴의 버 구멍이 보입니다. 죽은 조직이 보이지 않으면 뇌졸중이 발생하지 않았을 가능성이 높습니다. 버 구멍이 스트로크 위의 중앙에 있지 않으면 중앙에 맞게 다시 드릴합니다.
4. 주입 펌프를 마우스 위로 향하게 하고 90°로 잠급니다. 재료를 다시 로드하기 전에 멸균 식염수 또는 PBS 용액으로 주사기를 청소하십시오.
   1. 깨끗해지면 바늘이 없도록 유리 주사기를 분해합니다. 10μL의 하이드로겔(또는 세포가 있거나 없는 다른 생체 재료)이 포함된 25μL 용적식 피펫을 사용하여 주사기를 다시 로드합니다.
   2. 주사기 플런저를 사용하여 젤을 주사기 앞쪽까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 주사기를 다시 조립하고 젤이 바늘에서 눈에 띄게 흘러나올 때까지 계속 누릅니다
.
5. 주사기를 펌프에 놓습니다. 주사기가 맞도록 펌프 뒷면을 조정해야 할 수도 있습니다. 유속을 30 μL/min으로 조정하고 이동해야 하는 방향에 따라 Withdrawal 또는 Inject를 선택한 다음 Start를 누릅니다. 펌프 뒷면이 올바른 위치에 있을 때 중지를 누르십시오.
   1. 주사기가 고정되도록 펌프 뒷면을 조입니다. 이전에 조정한 경우 유속이 1 μL/min으로 다시 설정되고 주입되도록 설정되어 있는지 확인하십시오.
6. 펌프를 x 및 y 방향으로 움직여 구멍 위의 방향을 지정합니다. 주사기의 바늘이 구멍 상단에 닿을 때까지 펌프를 z 방향으로 아래로 움직입니다.
7. 디지털 디스플레이 콘솔에서 Z를 재설정합니다. 그런 다음 주사기를 z 방향으로 0.750mm 아래로 움직입니다. 주사기가 구부러지거나 저항이 있으면 두개골이 치유되었거나 완전히 뚫지 않았으므로 다시 뚫어야 합니다.
8. 펌프 콘솔에서 시작을 눌러 1 μL/min의 속도로 4 - 6 μL의 하이드로겔을 주입합니다.
9. 젤이 가교를 시작할 수 있도록 펌프가 주입을 멈출 때 5분 타이머를 설정합니다.
10. 5분 후 z-nob을 돌려 주사기를 천천히 위로 당깁니다. 실수로 구멍에서 재료가 당겨지거나 누출되지 않도록 관찰하십시오. 펌프의 잠금을 해제하고 바늘이 두개골에서 충분히 멀리 떨어져 있을 때 마우스에서 멀리 옮깁니다.
11. 겸자, 수술용 접착제 또는 봉합사를 사용하여 머리 위의 피부를 봉합합니다. 마우스를 깨끗한 케이지에 넣고 회복을 관찰합니다. 마우스가 마취에서 회복되는 데 약 5-10분이 소요됩니다.

결과

그림 1: bregma의 개략적 표현 및 뇌졸중의 국소화. (A) 정수리엽은 상단에서 만나 브레그마를 형성합니다. 레이저 배치는 브레그마에서 왼쪽 2.0mm 중앙에 위치했습니다. (B) 뇌졸중 및 뇌졸중 후 5일 후에 버 구멍의 육안 확인이 보였다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25uL 해밀턴 주사기 702RN, 바늘 없음	Fishcer Scientific	14824663	생체 재료 주입에 사용되는 주사기
25uL 용적식 피펫 Gilson		M-25
조정 가능한 스테이지 플랫폼	Kopf 기기	901
C57BL/6 마우스	잭슨 연구소	664	8-12주 케이
지 어셈블리 Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" 길이, 직경 6mm, 4팩 - sterotax에 레이저 부착용
봉	VWR	89031-288
CP 25 피펫 팁	Gilson	F148012
가열판	Kopf 악기	HP-4M
IMPAC 6-통합 다중 환자 마취 센터	VetEquip	901808
Jewlers 겸자 #5	GFS 화학 물질	46085
Miltex Adson 드레싱 겸자, 해부 등급	Intefra Miltex	V96-118
미니 펌프 가변 유량	Thomas Scientific	70730-064	펌프 관류 마우스
가스 무감각증 헤드 홀더	Kopf Instruments	923-B
나노젯 컨트롤 박스	Chemyx	10050
나노젯 펌프 헤더	Chemxy	10051	생체 재료 주입을 위한 정위 고정 장치에 부착
바늘 RN 30G PT STY 3, 0.5인치	Fishcer Scientific	NC9459562
비 파열 이어 바 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet 연고	Dr. Foster Smith	9N-76855
직장 프로브 마우스	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 1/2 단위 표시가 있는 인슐린 주사기 0.5mL	VWR	10002-726	장미 벵골 주입
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