이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
성인 murine 두뇌에서 putative 신경 줄기 세포 (NSCs)의 분리 및 확장 먼저 neurosphere 분석 (NSA)으로 알려진 화학적으로 정의된 혈청 무료 문화 시스템을 채용 1992 년 레이놀즈와 바이스에 의해 설명되었다. 이 분석에서 차별화된 세포 유형의 대부분이 문화의 몇 일 이내에 죽을 성장 인자 반응 전구체 세포의 작은 인구는 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 기본 fibroblastic 성장 인자 (bFGF)의 존재에서 활약 확산을 받고있다. 이러한 세포가 차례로 신경 줄기 세포의 수영장을 확장 subcultured 수 있습니다 neurospheres 불리는 undifferentiated 세포의 콜로니를 형성하고 있습니다. 또한, 세포는 CNS의 즉, 뉴런, astrocytes, oligodendrocytes 및의 세 가지 주요 세포 유형을 생성 차별화하는 유도하실 수 있습니다. 이 분석은 체외 연구에서 또한 치료 목적으로 사용할 수 undifferentiated CNS의 엽 성의 전구 물질의 일관성 재생 소스를 제공하는 소중한 도구를 제공합니다.
이 비디오는 성인 마우스 periventricular 지역에서 NSCs를 생성하고 확장하는 NSA 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다. 절차는 NSA의 성인 마우스, periventricular 지역의 미세 해부, 조직 준비와 문화의 머리를 수확이 포함되어 있습니다. 수확 조직 처음 화학적으로 단일 세포 현탁액을 달성하고 마지막으로 NSA의 도금에 NSC 매체에서 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 그리고 기계 dissociated를 사용하여 소화됩니다. 문화 70~10일 후, 그 결과 기본 neurospheres 앞으로 실험에 필요한 세포의 양을 도달 subculture에 대한 준비가되어 있습니다.
프로토콜
1 부 : 기본 해부하기 전에 설정 :
- 적절한 볼륨이 각각 9시 1분 비율 NeuroCult NSC 기초 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보조 식품을 혼합하여 준비가되어 있습니다. NSC 매체는 또한 문학에 발표된 NSC 성장 매체의 구성을 기반으로 실험실에서 만들 수 있습니다 1. 귀하의 연구실 중간 만들기로 많은 경험이 없다면, 우리는 강력하게 품질 (NeuroCult, 줄기 세포 Technolgies의 경우 어떤) 판매되고 이전에 NSCs의 성장을위한 조절되어 상업적으로 이용 가능한 매체를 사용하는 것이 좋습니다.
- 매체는 37 ° C의 물을 욕조에 워밍업이다. 콜드 HEPES - 버퍼 최소 필수 매체 (앙)은 절개와 세탁 목적을 위해 준비가되어 있습니다. 또한, 항생제의 보완과 함께 NSC 기초 매체는 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. 30-40 ML은 두뇌 수집 무균 50 ML 튜브에 적절합니다.
- 여러 10cm 플라스틱 배양 접시는 절개와 해부 조직을 보유 한 10cm 살균 유리 페트리 접시 동안 두뇌를 잡아 필요합니다.
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토론
neurosphere 분석 2 CNS 4-5에서 고립과 NSCs의 연구뿐 아니라 유방 6과 마음 7 등 많은 조직에서 putative 줄기 세포의 다른 종류의 격리를 위해뿐만 아니라 연구 커뮤니티의 광범위한 관심을 얻게하고있다 뇌, 유방 및 결장 종양의 줄기 세포이 문화 시스템은 체세포와 체내 종양 전구체 세포 집단의 숫자에 적용할 수있는 제안 8-9의 식별. 이 방법의 장점 중 일부는 단순, 재현성 및 조직의 작은 조각 또는 화학적으로 정의 혈청 무료 매체 세포도 소수의 세포의 무기한 번호 생성이 포함됩니다.
그것은 neurospheres는 타고난 줄기 세포에서 이상 제한 전구 세포에서 10 중 파생 수 있듯이 문화에 neurospheres의 수가 줄기 세포의 수를 나타냅니다하지 않는 강조해야합니다. 이런 점에서 분석이 올바르게 문화 11.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 오버 재단 기금에 의해 지원되었다.
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재료
* 앙을 만들려면, 1M HEPES의 멤 and160ml의 110L 패킷을 혼합하고 증류수를 사용하여 8.75 L로 볼륨을 가져. 7.4에 대한 최종 PH를 설정하고 그것은 4 ° C. 저장을
참고문헌
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central ne....
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재인쇄 및 허가
