신경 손상의 쥐 모델에서 복합 재생 말초 신경 인터페이스의 구성

Abstract

출처: Svientek, SR, et al. 성체 쥐에서 복합 재생 말초 신경 인터페이스(C-RPNI)의 제작. J. Vis. 경험. (2020).

이 비디오는 말초 신경 손상의 쥐 모델에서 복합 재생 말초 신경 인터페이스(C-RPNI)의 외과적 구성을 보여줍니다. 이 절차에는 절개된 비골 신경을 근육 이식편에 부착하고 이를 진피 피부 이식편으로 오버레이하여 신경 재생을 촉진하는 과정이 포함됩니다. 시간이 지남에 따라 운동 및 감각 뉴런은 이식편 내에서 연결을 재확립하여 기능적 신경근 및 감각 구조의 형성을 가능하게 합니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

참고: 기증자 쥐는 피부 및 근육 기증 절차 전에 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있습니다. 안락사는 깊은 마취 하에 시행된 후 양측 기흉의 2차 방법으로 심장 내 염화칼륨 주사를 시행합니다. 이론적으로 모든 쥐 계통을 이 실험에 활용할 수 있습니다. 그러나 우리 연구실은 생후 2-4개월에 수컷 및 암컷 Fischer F344 쥐(~200-250g) 모두에서 일관된 결과를 달성했습니다. 기증자 쥐는 실험 쥐와 동유전자여야 합니다.

1. 진피 이식편의 준비

1. 0.8-1 L/min의 산소 속 5% 이소플루란 용액을 사용하여 유도 챔버에서 기증자 쥐를 마취합니다. 쥐가 마취되면 유도실에서 꺼내 재호흡 노즈콘 위에 놓고 마취 유지를 위해 이소플루란을 2-2.5%로 낮춥니다.
2. 진통을 위해 0.2mL의 멸균 식염수에 0.02-0.03mL 카프로펜(50mg/mL) 용액을 견갑골 사이에 피하
투여합니다.
3. 각막궤양을 예방하기 위해 양쪽 눈에 인공눈물 연고를 바르십시오.
4. 이발기를 사용하여 하부 뒷다리 전체, 발목 부위 및 발 측면을 면도합니다.
5. 선택한 뒷다리와 발바닥 표면을 알코올로 세척한 다음 요오도포비돈 용액을 세척한 다음 잔류 요오도포비돈을 제거하기 위해 알코올로 최종 세척으로 마무리합니다.
탈
6. 착식 원형 미세 입자 연마석(4000rpm)이 있는 휴대용 마이크로 모터 고속 드릴을 사용하여 발의 발바닥 표면을 버핑하여 표피를 제거합니다. 버링하는 동안 피부에 화상을 입지 않도록 식염수를 떨어뜨립니다. 밑에 있는 진피는 정확한 출혈과 함께 반짝이는 모양을 갖게 됩니다.
7. 혈류를 늦추기 위해 하지에 지혈대를 착용하십시오.
8. #15 메스로 발바닥 피부를 날카롭게 제거하고 건조를 방지하기 위해 식염수에 적신 거즈에 넣습니다. 일부 힘줄 및 결합 조직은 본질적으로 이 단계에서 피부와 함께 제거되며 나중에 제거됩니다.
9. 출혈을 늦추기 위해 출혈이 있는 발에 거즈 랩을 씌웁니다. 두 개의 구문을 수행하는 경우 1.5-1.9단계를 반복합니다.
10. 현미경(20배 배율)에서 미세가위를 사용하여 피부 이식편의 깊은 층에서 힘줄 및 결합 조직을 제거합니다. 이식편에 구멍이 생기지 않도록 주의하십시오. 얇아진 진피 이식편은 진피만 포함하는 약간 불투명해야 하며 크기는 약 0.5cm x 1.0cm입니다.
11. C-RPNI 구조물 제작이 준비될 때까지 식염수에 적신 거즈에 넣습니다. 이식편은 수확 후 2시간 이내에 사용해야 합니다.

2. 근육 이식편 준비

1. #15 메스로 발목 바로 위에서 무릎 바로 아래까지 하부 뒷다리 앞쪽을 따라 세로로 절개합니다. 피하 조직을 해부하여 밑에 있는 근육 조직을 노출시킵니다.
2. 절개의 원위 부분에서 하지 근육 조직의 힘줄 삽입을 노출시킵니다. 전경골근(TA)은 일반적으로 근육 중 가장 크고 가장 앞쪽에 있으며, 이 근육 바로 아래와 뒤쪽에는 장지신근(EDL)이 있습니다. 원위 EDL 힘줄을 해당 부위의 다른 힘줄로부터 분리하고 이 시점에서 삽입을 절개하지 않도록 주의합니다.
힘
3. 줄 아래에 집게의 양쪽 갈래를 삽입하고 집게를 열어 위쪽으로 압력을 가하여 힘줄 편위를 일으켜 올바른 힘줄을 분리합니다. 이 힘줄을 조작하면 모든 발가락이 동시에 확장되어야 합니다.
4. 날카로운 홍채 가위로 원위 건절개술을 수행하고 건절개술(또는 기타 끝이 뭉툭한 가위)을 사용하여 주변 조직에서 근육을 뭉툭하게 분리하여 근위부에서 힘줄 기원을 찾습니다.
5. 근위 힘줄이 시각화되면 날카로운 홍채 가위를 사용하여 다시 건절개술을 수행합니다. 건조를 방지하기 위해 근육 이식편을 식염수에 적신 거즈에 넣습니다.
6. 기증자 쥐에서 원하는 모든 이식편을 제거한 후, 주로 심장 내 KCl 주사(1-2 mEq K+/kg)에 의해 안락사시킨 후 #15 블레이드를 사용한 양측 천자 기흉으로 2차 안락사

를 시행합니다.

3. 총비골 신경 격리 및 준비

1. 1.1-1.3단계에 설명된 프로토콜에 따라 실험 쥐에게 마취 및 진통 제공.
2. 원하는 허벅지를 면도하고 알코올, 베타딘으로 클렌징하고 알코올로 마무리하여 베타딘의 흔적을 제거합니다.
3. 동물을 수술 준비 테이블에서 수술용 현미경 테이블로 옮기고 체온 유지를 위해 온도 프로브가 있는 가열 패드 위에 놓습니다. 이소플루란을 2-2.5%로, 산소를 0.8-1L/min으로 유지합니다.
좌
4. 골 노치의 원위부에서 무릎의 아래쪽 부분까지 확장되는 절개를 표시합니다. 이 표시는 대퇴골보다 열등하고 대퇴골에서 멀어지는 각도여야 합니다. #15 칼날로 밑에 있는 대퇴이두근 근막을 절개합니다.
5. 지혈제나 끝이 뭉툭한 미세가위를 사용하여 대퇴이두박근 밑에 있는 공간까지 대퇴이두박근을 조심스럽게 해부합니다.
   참고: 좌골 신경은 처음 절개한 것과 거의 같은 방향으로 이동합니다. 일반적으로 비복 신경 후방과 총비골 및 경골 신경이 각각 무릎 표면과 깊숙부로 이동하는 세 가지 가지가 있습니다.
6. 총비골(CP) 신경을 식별한 후 한 쌍의 미세하고 끝이 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 CP 신경을 다른 좌골 가지에서 조심스럽게 분리하고 원위부로 남아 있는 결합 조직을 제거합니다.
7. 신경이 무릎 표면을 가로지르는 지점에서 미세가위로 신경을 날카롭게 절단합니다.
   참고: 신경에 심각한 외상을 입히면 신경종 형성의 위험이 높아질 수 있으므로 이 단계에서는 날카로운 가위를 사용하는 것이 매우 중요합니다.
8. CP 신경에서 남아 있는 결합 조직을 조심스럽게 제거하고 근위부에서 작업하여 신경을 약 2cm 길이로 풀어줍니다.

4. C-RPNI 구조물 제작

1. 식염수에 적신 거즈에서 근육 이식편을 제거하고 모든 중앙 힘줄 조직과 근외의 작은 중앙 부분을 제거합니다. 힘줄 끝은 그대로 두십시오.
2. 8-0 사용 나일론 봉합사, CP 신경의 절개된 말단의 신경외막을 신경의 양쪽에 두 개의 단절 봉합으로 근외피가 없는 근육 이식편 부위에 고정합니다.
3. 신경-근육 접합부가 대퇴골에서 반대쪽을 향하도록 근위부 및 원위 모두에서 단일 6-0 나일론 단속 스티치로 근육 이식편을 대퇴골 골막에 고정합니다.
   참고: 근육이 정상적이고 이완된 길이가 되도록 고정합니다. 고정할 때 근육을 크게 늘리거나 너무 느슨해지지 않도록 하십시오.
4. 8-0 배치 근육 이식편 근외의 하부 중앙 가장자리에 나일론 스티치를 실어 근육 이식편 내의 신경에 느슨함을 만들고 나중에 보행할 때 노출될 수 있는 미래의 긴장을 완화하는 데 도움이 되는 방식으로 CP 신경 신경외막에 고정합니다.
5. 식염수에 적신 거즈에서 피부 이식편을 제거하고 신경과 근육의 대부분을 완전히 덮도록 근육 이식편에 배열합니다. 진피의 깊은 가장자리가 근육 위에 놓여 있는지 확인하십시오. 근육의 경계를 넘어 뻗어 있는 진피를 다듬습니다.
6. 8-0을 사용하여 피부 이식편을 근육 이식편에 원주 방향으로 고정합니다. 나일론은 봉합사를 중단했습니다. 일반적으로 구조물의 크기에 따라 총 4-8개의 봉합사가 사용됩니다.
7. 5-0 크롬 봉합사로 구조물 위의 대퇴이두근 근막을 달리기 방식으로 닫습니다.
8. 러닝 방식으로 4-0 크롬 봉합사로 위에 있는 피부를 봉합합니다.
9. 알코올 패드로 수술 부위를 면봉으로 닦고 항생제 연고를 바릅니다.
10. 흡입 마취를 중단하고 쥐가 케이지 동료와 분리된 음식과 수원으로 회복할 수 있도록 하십시오.

Materials