마이크로웰 어레이에서 박테리아 콜로니의 광분해성 하이드로겔 기반 분리

초록

출처: Fattahi, N., et al. 박테리아 스크리닝, 선택 및 분리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스. J. Vis. 경험. (2021년)

이 비디오는 실리콘 마이크로웰 어레이 내에서 박테리아 콜로니를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 세포는 먼저 마이크로웰에 로드되고 가교 하이드로겔에 캡슐화되고 별개의 콜로니로 배양됩니다. 자외선에 노출되면 하이드로겔의 표적 분해를 통해 개별 콜로니를 선택적으로 추출할 수 있습니다.

프로토콜

1. 박테리아 균주 및 배양 프로토콜

1. 적절한 성장 배지가 보충된 한천 플레이트에 박테리아 군집을 줄무늬로 만듭니다. 본 보고서에서 Bacillus subtilis(균주 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center)를 ATGN(0.079 M KH₂PO₄, 0.015 M(NH₄)₂SO₄, 0.6 mM MgSO₄·7H₂O, 0.06 mM CaCl₂·2H₂O, 0.0071 mM MnSO₄·H₂O, 0.125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mM 포도당, pH: 100 μg/mL 암피실린이 보충된 ATGN 한천 플레이트에 100 μg/mL 스펙티노마이신 및 대장균(균주 25922, ATCC)이 보충된 7 ± 0.2, 15 g/L 한천) 한천 플레이트.
   참고: 하이드로겔 캡슐화 및 방출에 대한 이전 보고는 대신 A. tumefaciens C58 세포를 사용했습니다
.
2. ATGN 한천 플레이트에서 원하는 콜로니를 선택하고 하룻밤 배양을 시작합니다. 여기에 사용된 대장균 및 B. subtilis 균주의 경우, ATGN 액체 배지에서 215rpm으로 24시간 동안 흔들면서 37°C에서 배양합니다. 나중에 사용할 때까지 세포 배양액을 -80°C의 50% 글리세롤에 보관합니다.
3. 멸균 접종 루프를 사용하여 글리세롤 스톡에서 두 균주의 콜로니를 선택하고 ATGN 액체 배지에서 37°C 및 215rpm에서 24시간 동안 배양합니다.

2. 하이드로겔 형성에 필요한 물질의 제조

1. 광분해성 폴리(에틸렌글리콜)-o-니트로벤질 디아크릴레이트(PEG-o-NB-디아크릴레이트) 합성
   참고: PEG-o-NB-디아크릴레이트의 사내 합성은 잘 설명되었으며 이전에 보고되었습니다. 또는 합성이 일상적이기 때문에 화학 합성 시설에서 아웃소싱할 수 있습니다.
2. 가교 완충제
   1. 박테리아 균주에 대해 선택한 배지의 레시피를 취하고 2배의 영양소가 포함된 배지를 준비합니다. 인산염, 예를 들어 NaH₂PO₄를 배지에 최종 농도 100 mM로 첨가합니다. 그런 다음 5M NaOH(aq)를 사용하여 pH 값을 8로 조정합니다.
   2. 완충 용액을 멸균하고 추가 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
      참고: 이러한 금속은 티올의 이황화물로의 산화를 촉매하므로 매질에 존재하는 모든 전이 금속을 제외하십시오.
3. PEG-o-NB-디아크릴레이트 solution
   1. 분취량 PEG-o-NB-디아크릴레이트(분자량 3,400Da) 분말 각 mg에 대해 초순수 3.08μL를 첨가하여 49mM 농도의 PEG-o-NB-디아크릴레이트(98mM 아크릴레이트 농도)에 도달합니다.
   2. 용액이 잘 섞일 때까지 소용돌이치고 추가 사용할 때까지 이 용액을 -20°C에서 보관합니다.
4. 4-arm PEG-thiol solution
   1. 4-arm PEG-thiol(10,000 Da 분자량) 준비의 경우 분말 mg당 초순수 4 μL를 첨가하여 20 mM 농도(티올 농도 80 mM)에 도달합니다.
   이
   2. 용액이 잘 섞일 때까지 소용돌이치고 추가 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.

5. 실리콘 마이크로웰 어레이

1. 파릴렌 코팅 제작: 이전 연구 기사에 설명된 표준 프로토콜을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 파릴렌으로 코팅합니다.
2. 미세 가공: 문헌에 설명된 프로토콜에 따라 마이크로웰 어레이를 설계하고 제작합니다(그림 1).
   참고: 표준 포토리소그래피 기술을 적용하여 파릴렌 코팅된 실리콘 웨이퍼에 마이크로웰 어레이를 제작했습니다.

7. 마이크로웰 어레이 위의 하이드로겔 형성

1. 마이크로웰 어레이
   참고: 0.1 OD₆₀₀(파장 600nm의 광학 밀도) 세포 현탁액 700μL를 마이크로웰 어레이 기질 위에 시딩하고 파릴렌 리프트오프 방법을 적용하여 배경에서 세포를 제거했습니다.
2. 5.6μL의 PEG-o-NB-디아크릴레이트와 12.5μL의 pH 8 인산염 완충 식염수 ATGN을 첨가하고 6.9μL의 4군 PEG 티올 용액과 혼합하여 하이드로겔 전구체 용액을 준비합니다.
3. 비반응성 과불화알킬화 유리 슬라이드에 전구체 용액 12.5μL를 피펫팅하고 세포가 접종된 마이크로웰 어레이 기질의 반대쪽 두 면에 2개의 38μm 강철 스페이서( 재료 표 참조)를 놓습니다.
4. 전구체 용액 방울로 과불화알킬화 유리 슬라이드를 뒤집고 액적을 마이크로웰 기판 중앙에 놓습니다. 그런 다음 하이드로겔 형성을 위해 실온(RT)에서 25분 동안 배양합니다.
5. 마이크로웰 기판에서 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다. 하이드로겔 멤브레인은 마이크로웰 기판에 부착된 상태로 유지되어야 합니다.

결과

그림 1: 마이크로웰 어레이의 설계 및 제작. (A) 마이크로웰 어레이를 제작하기 위해 표준 미세 가공 기술이 적용되었습니다. 실리콘 웨이퍼. (B) 각 기판은 깊이 20μm, 피치 30μm의 직경 10μm 웰 7 x 7 어레이로 구성되었습니다. (C) 각 어레이는 225개의 마이크로웰로 구성되었습니다. 이 그림은 Barua et a...

재료