그람 음성 박테리아의 내막 및 외막 분획의 분리

초록

출처: Cian, M. B. et. al., Acinetobacter baumannii에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 세포 외피를 내막 및 외막 분획으로 분리. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 자당 구배 초원심분리를 사용하여 그람 음성 박테리아의 내막 및 외막 분획을 분리하는 방법을 보여줍니다. 멤브레인 분획은 멤브레인 특정 성분의 표적 분석을 위해 정제 및 저온에서 저장됩니다.

프로토콜

1. 멤브레인 추출을 위한 일반 시약 및 배지 준비

1. 박테리아 성장 배지: 철저히 세척하고 고압멸균한 2L 플라스크에 1L의 국물 배지를 준비하고 멸균합니다.
2. 일반 재현탁 완충액(1M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충액(Tris 완충액) pH 7.5; 50mL): 트리스 염기 6.05g을 H₂O 30mL에 용해하고, 5M HCl로 pH를 7.5로 조정하고, 초순수_H2O로 최종 부피를 50mL로 조정합니다.
3. 2가 양이온 킬레이트화 용액(0.5M 에틸렌디아민 테트라아세트산, EDTA pH 8; 100mL)의 마스터 스톡: 에틸렌 테트라아세테이트·2H₂O이나트륨 18.6g을 H₂O 80mL에 첨가하고, 세게 저어주고 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 8.0으로 조절한다. 초순수 H₂O.
   참고: EDTA의 이나트륨염은 NaOH를 첨가하여 용액의 pH가 ~8.0으로 조정될 때까지
용해되지 않습니다.
4. 삼투압 완충액 A(0.5M 자당, 10mM Tris pH 7.5; 1L): 자당 171.15g의 무게를 측정하고 1L 실린더로 옮깁니다. 1M Tris pH 7.5 10mL를 첨가합니다. 초순수 H₂O로 최종 부피 1L로 조정하고 4°C에서 보관합니다.
5. 리소자임(10mg/mL; 5mL): (닭고기 달걀 흰자) 리소자임 50mg의 무게를 측정하고 5mL 초순수 H₂O에 용해시킵니다. 4°C에서 보관합니다.
희
6. 석된 2가 양이온 킬레이트화 용액(1.5mM EDTA; 500mL): 1.5mL의 0.5M EDTA(단계 1.3)를 497.5mL 초순수_H2O에 첨가하고 4°C에서 보관합니다.
7. 삼투압 완충액 B(0.2 M 자당, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): 자당 136.8 g의 무게를 측정하고 2 L 실린더로 옮깁니다. 20mL의 1M Tris pH 7.5를 첨가합니다. 초순수 H₂O로 최종 부피를 2L로 조정하고 4°C에서 보관합니다.
8. 뉴클레아제 보조 인자(1M 염화마그네슘, MgCl₂; 10mL): 2.03g의 MgCl₂·6H₂O를 8mL의 초순수 H₂O에 용해시킵니다. 부피를 10mL로 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.
9. RNase 및 DNase 효소를 포함한 뉴클레아제 용액 칵테일: 재료 표 참조. -20°C에서 보관하십시오.
10. 프로테아제 억제제 칵테일: 재료 표 참조. 4°C에서 보관하십시오.
11. 저밀도 isopycnic suchrose gradient 용액(20% w/v 자당, 1mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 용액, 100mL): 자당 20g의 무게를 측정하고 200mL 실린더로 옮깁니다. 100 μL의 1 M Tris 완충액 pH 7.5와 200 μL의 0.5 M EDTA pH 8을 추가합니다. 초순수 H₂O로 최종 부피를 100mL로 조정하고 실온에서 보관합니다.
12. 중밀도 등밀도 자당 구배 용액(53% w/v 자당, 1mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 용액, 100mL): 자당 53g의 무게를 측정하고 200mL 눈금 실린더로 옮깁니다. 100 μL의 1 M Tris 완충액 pH 7.5와 200 μL의 0.5 M EDTA pH 8을 추가합니다. 초순수 H₂O로 최종 부피를 100mL로 조정하고 실온에 보관합니다.
    참고: 자당 비율이 높기 때문에 정확성을 보장하기 위해 이 용액을 눈금 실린더에 준비하십시오. 자기 교반 막대를 추가하고 자당이 용액에 완전히 용해될 때까지 저어줍니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
13. 고밀도 등밀도 자당 구배 용액(73% w/v 자당, 1mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 용액, 100mL): 자당 73g의 무게를 측정하고 200mL 눈금 실린더로 옮깁니다. 100 μL의 1 M Tris 완충액 pH 7.5와 200 μL의 0.5 M EDTA pH 8을 추가합니다. 초순수 H₂O로 최종 부피를 100mL로 조정하고 실온에 보관합니다.
    참고: 자당 비율이 높기 때문에 정확성을 보장하기 위해 이 용액을 눈금 실린더에 준비하십시오. 마그네틱 교반 바를 넣고 자당이 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
14. 분리된 멤브레인 저장 완충액(10 mM Tris 완충액 pH 7.5; 1 L): 1 mL의 1 M Tris 완충액 pH 7.5를 1 L 플라스크에 넣고 초순수 H₂O로 최종 부피를 1 L로 조정합니다.

2. 막 추출을 위한 박테리아 준비

1. 냉동 글리세롤 스톡에서 박테리아를 신선한 한천 플레이트에 줄무늬로 만듭니다. 콜로니가 발달하면 플레이트를 4°C에서 보관합니다. 국물 배지로 채워진 5mL 튜브에 단일 콜로니를 접종하고 밤새 원하는 대로 박테리아를 배양합니다.
2. 하룻밤 박테리아 배양액을 1L의 선호하는 국물 배지에 역희석하고 원하는 광학 밀도에 도달할 때까지 박테리아를 배양합니다.
   참고: 성장 표현형을 억제하기 쉬운 돌연변이 유전자형에는 단일 박테리아 콜로니를 1L의 국물 배지에 접종하는 것이 권장되지만 일부 그람 음성 박테리아는 다른 박테리아보다 더 느리게 성장합니다. 단일 콜로니 접종으로 충분한 배양 밀도를 달성할 수 없는 경우 하룻밤 배양을 1L의 배지로 역희석하는 것이 성장을 동기화하는 한 가지 전략입니다. 박테리아-막 구성은 배양의 성장 단계(로그 대 고정 단계)에 따라 다릅니다. 배양 밀도와 성장 단계를 연관시키기 위해 박테리아 배양의 광학 밀도 변화를 시간의 함수로 측정하는 성장 곡선을 모든 균주에 대해 수행해야 합니다.
3. 국물 배양액이 담긴 플라스크를 얼음 위에 놓습니다. 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 읽고 6.0에서 8.0 x 10¹¹ 박테리아 콜로니 형성 단위(CFU)에 해당하는 배양량을 계산합니다. S. Typhimurium의 경우, OD600 1.0은 대략 1.0x10⁹ CFU/mL와 같기 때문에 이는 0.6 - 0.8 사이의 OD₆₀₀에서 1 L의 배양에 해당합니다. 이 부피를 원심분리기 튜브에 넣고 나머지 배양액이 사용할 때까지 얼음 위에 남아 있는지 확인합니다.
4. 고정 각도 고속 원심분리기에서 7,000-10,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다.
   참고: 원심분리기를 예냉하고 저온으로 유지합니다. 전체 절차 동안 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
5. 상청액을 디캔팅하고 조심스럽게 버립니다.
   참고: 멤브레인 분획을 즉시 추출하지 않을 경우 펠릿을 급속 냉동 및/또는 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나 특히 비장내세균 종의 경우 세포를 채취한 당일에 직접 형질분해를 진행하는 것이 좋습니다.

3. 외막의 해리 및 플라즈몰리시스

이전에

1. -80°C에서 보관된 경우 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 나머지 절차 동안 샘플을 얼음 위에 보관합니다. 원심분리기 튜브 내의 각 세포 펠릿을 12.5mL의 완충액 A에 재현탁합니다. 세포 현탁액에 자기 교반 바를 추가합니다.
2. 각 세포 재현탁액에 180μL의 10mg/mL 리소자임(최종 농도 144μg/mL)을 첨가합니다. 2분 동안 저어주면서 샘플을 얼음 위에 보관합니다.
3. 각 세포 재현탁액에 12.5mL의 1.5mM EDTA 용액을 첨가하고 얼음 위에서 추가로 7분 동안 계속 저어줍니다.
4. 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브에 디캔팅하고 4°C에서 10분 동안 9,000-11,000 x g로 원심분리합니다.
5. 상청액을 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
6. 세포 펠릿에 25mL의 완충액 B를 첨가합니다.
1
7. M MgCl₂ 55 μL, RNase/DNase 뉴클레아제 시약 1 μL(균질화 전에 형질분해를 겪는 박테리아와 관련된 점도 문제를 방지하기 위해) 및 1 μL의 프로테아제 억제제 칵테일을 세포 펠릿 위에 있는 완충액 B의 부피에 첨가
합니다
8. . 균질한 용액이 관찰될 때까지 세게 피펫팅하고 소용돌이치십시오.
   참고: 이 프로토콜의 4단계로 진행하기 전에 균질한 용액을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 재현탁된 세포는 점성이 있는 케이크 반죽과 같은 모양과 일관성을 가져야 합니다.
9. 각 샘플을 15초 동안 소용돌이치게 합니다. 얼음 위에 현탁액을 유지하고 4단계로 진행합니다.

4. 가압 균질화 및 용해
참고: 용해에는 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 초음파 처리는 열 발생으로 인해 이상적이지 않습니다. 삼투압 용해는 달성될 수 있지만 종종 비효율적입니다. 따라서 고압 용해를 권장합니다. 고압 용해는 다양한 기기를 사용하여 달성할 수 있습니다. 프렌치 프레스 또는 Emusliflex와 같은 균질화 기계를 제안합니다. 우리는 높은 삼투압 자당 용액에 대한 반응이 다양한 다양한 유형의 그람 음성 박테리아를 연구합니다. 고압 균질화 단계는 효율성, 재현성 및 수율을 향상시킵니다.

1. 프렌치 프레스 셀을 4°C로 미리 식히거나 균질화기 기계의 금속 코일을 얼음 위에 삽입합니다.
2. 샘플을 프렌치 압력 셀 또는 균질화기-샘플 실린더에 붓고 셀을 원하는 균질화 압력(프렌치 프레스를 사용할 경우 10,000psi, 균질화기를 사용할 경우 20,000psi가 적절해야 함)으로 가져옵니다.
3. 프렌치 프레스를 사용하는 경우 압력을 유지하면서 출구 유량을 초당 약 한 방울로 조정하십시오.
샘플
4. 을 얼음 위에 보관하면서 50mL 원뿔형 튜브에 세포 용해물을 수집합니다.
5. 4.2-4.4단계를 3-5회 반복하여 완전한 용해를 달성하며, 이는 일반적으로 샘플의 투명도가 점진적으로 증가하는 것으로 표시됩니다.
   참고: 샘플 챔버는 샘플 사이에 버퍼 B로 세척하고 평형을 유지해야 합니다.
6. 용해된 세포를 얼음 위에 보관하십시오.

5. 총 막 분획

용

1. 해된 박테리아 샘플을 4°C에서 10분 동안 6,169 x g로 원심분리하여 나머지 온전한 세포 물질을 펠릿화합니다. (예: 용해되지 않은 박테리아 세포).
2. 이제 균질화된 멤브레인을 포함하는 상청액의 나머지 부분을 초원심분리를 위해 폴리카보네이트 병에 분배합니다.
   주의: 필요한 경우 버퍼 B로 희석하여 세포 샘플의 균형을 맞출 수 있습니다.
3. 세포 용해물을 184,500 x g에서 4°C에서 최소 1시간 동안 초원심분리합니다. 이 단계는 멤브레인의 품질에 영향을 주지 않고 밤새 수행할 수 있습니다.
4. 초원심분리기 튜브에 존재하는 나머지 상청액을 버리고 멤브레인 펠릿을 얼음 위에 보관합니다(그림 1).
5. glass-Dounce 균질화기를 사용하여 저밀도 isopycnic-sucrose 그래디언트 용액 1mL에 멤브레인 펠릿을 재현탁합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플 균질을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
   참고: 전체 멤브레인 조성 분석만 원하는 경우 1mL의 분리된 멤브레인 저장 완충액을 1mL의 저밀도 isopycnic-suchrose 구배 용액으로 대체합니다. 단계 5.5는 전체 박테리아 막 샘플만 원하는 경우 분리의 종점입니다. 추가 다운스트림 분석이 필요할 때까지 샘플을 -20°C에서 보관하십시오.

6. 이중 멤브레인을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리

스

1. 윙 버킷 로터 및 초원심분리기에 지정된 적절한 수의 13mL 폴리프로필렌 또는 초투명 개방형 튜브를 수집합니다.
2. 튜브를 약간 기울인 위치에 놓고 자당 용액을 다음 순서로 고밀도에서 저밀도로 천천히 첨가하여 자당 구배를 준비합니다.2mL의 73% w/v 자당, 1mM EDTA, 1mM Tris pH 7.54mL의 53% w/v 자당, 1mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5
   1. 다음, 20% w/v 자당 용액에 재현탁된 총 막 분획(1mL)을 추가합니다(단계 5.5). 막 분획을 그 아래에 있는 자당 용액과 혼합하지 마십시오. 이러한 각 레이어 사이에 구분이 표시되어야 합니다.
   2. 마지막으로 저밀도 등피체-자당 그래디언트 용액(약 6mL)으로 튜브를 채웁니다. 폴리프로필렌 및 초투명 개방형 튜브는 튜브 지지를 위해 가능한 한 가득 채워야 합니다(튜브 상단에서 2mm 또는 3mm).
3. Acinetobacter baumannii 17978에 대한 조정
   1. 다른 박테리아 표본에 사용하기 위해 조정된 자당 구배를 조정합니다. A. baumannii의 경우, 다음 자당 구배는 막의 보다 완전한 분리를 제공했습니다(그림 2).2mL의 73% w/v 자당, 1mM EDTA, 1mM Tris pH 7.54mL의 45% w/v 자당, 1mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5
   2. 다음으로, 20% w/v 자당 용액에 재현탁된 총 막 분획(1mL)을 추가합니다(단계 5.5). 막 분획을 그 아래에 있는 자당 용액과 혼합하지 마십시오. 이러한 각 레이어 사이에 구분이 표시되어야 합니다.
   3. 마지막으로 튜브에 저밀도 등피체-자당 구배 용액(약 6mL)을 채웁니다. 폴리프로필렌 및 초투명 개방형 튜브는 튜브 지지를 위해 가능한 한 가득 채워야 합니다(튜브 상단에서 2mm 또는 3mm).
스
4. 윙 버킷 로터를 사용하여 샘플을 288,000 x g 및 4°C에서 밤새 초원심분리합니다.
   참고: 이전 단계에서 사용된 부피의 경우 16시간에서 23시간 사이의 원심분리 시간을 권장합니다.
5. P1000 피펫 팁의 끝을 지점에서 약 5mm 떨어진 곳에서 자릅니다. 피펫을 사용하여 상부 갈색 내막(IM) 층을 제거합니다. 초원심분리를 위해 IM 분획을 폴리카보네이트 병에 옮깁니다.
6. 하부 백색 외막(OM)이 IM 분획으로 교차 오염되지 않도록 53-73% 계면 위에 약 2mL의 자당 용액을 남겨 둡니다. OM 분획에 대해 6.4단계부터 피펫팅 절차를 반복합니다(그림 1).
   참고: 멤브레인은 바늘로 바닥의 원심분리기 튜브에 구멍을 뚫고 분획으로 적하하여 수집할 수도 있습니다.
7. 초원심분리기 튜브의 나머지 빈 공간을 분리된 멤브레인 저장 완충액으로 채우고 반전 또는 피펫팅으로 혼합합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
8. 4°C에서 1시간 동안 184,500 x g에서 초원심분리하여 현재 세척 및 분리된 멤브레인을 수집합니다.
9. 상청액을 버리고 Dounce 균질화에 의해 막을 재현탁합니다. 500-1000μL의 저장 완충액을 추가합니다. 2mL 미세 원심분리기 튜브에 샘플을 수집합니다.
10. 박테리아 막 샘플을 -20°C에서 보관합니다.

결과

그림 1: 이 방법 기사에 설명된 그람 음성 박테리아 막 분리 절차를 묘사하는 개략도. 박테리아 세포를 수집하고 전체, 내막(IM) 및 외막(OM)을 분리하는 데 사용되는 절차가 표시됩니다. 이 접근법은 IM 이중층의 밀도에 비해 이러한 미생물에 대한 OM 이중층의 증가된 밀도에 의존합니다.

재료