박테리아에서 무기 폴리인산염의 정량화를 위한 분석

초록

출처: Pokhrel, A., et al. 박테리아의 무기 폴리인산염 분석. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 박테리아 샘플에서 무기 폴리인산염(polyP)을 측정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 이 절차에는 폴리P를 유리 인산염으로 효소적으로 전환한 다음 몰리브덴산염 및 아스코르브산과 반응하여 파란색 복합체를 생성하는 과정이 포함됩니다. 이 복합체의 흡광도를 알려진 인산염 농도의 표준 곡선과 비교함으로써 박테리아 샘플의 polyP 함량을 정확하게 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 폴리인산염 추출을 위한 샘플 채취

1. polyP 함량을 결정하기 위해 관심 조건에서 박테리아를 배양합니다. 이 프로토콜의 경우, 시스테인(MEI-C)이 없는 말산 효소 유도(MEI) 배지에서 흔들지 않고 37°C에서 밤새 락토바실러스 루테리를 성장시킵니다.
2. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 원심분리하여 총 50 – 100μg의 세포 단백질에 충분한 세포를 수확합니다(아래 3단계 참조). 대장균의 경우, 이것은 0.2 - 0.4의 A₆₀₀에서 로그상 배양 1mL입니다. L. reuteri의 경우 이것은 하룻밤 배양 1mL입니다. 관심 있는 다른 종에 대해 필요에 따라 조정하십시오.
3. 세포 펠릿에서 상청액을 완전히 제거합니다.
4. 세포 펠릿을 250μL의 GITC 용해 완충액(4M 구아니딘 이소티오시아네이트, 50mM Tris-HCl, pH 7)에 재현탁하고 95°C에서 10분 동안 배양하여 용해합니다. -80°C.
   참고: 고온에서 장기간 배양하면 가수분해에 의해 polyP가 분해될 수 있으므로 용해 시간과 일치해야 합니다. 용해물은 -80°C에서 무기한 보관할 수 있습니다.
   주의: 구아니딘 이소티오시아네이트는 카오트로픽 염이므로 장갑을 끼고 취급하고 유해 폐기물로 폐기해야 합니다.

2. 세포 용해물의 단백질 함량 측정

1. GITC 용해 완충액에 0, 0.1, 0.2 및 0.4mg ^mL-1의 BSA를 함유한 소 혈청 알부민(BSA) 표준물질을 준비합니다.
   참고: GITC는 Bradford 분석의 색상 발달에 영향을 미치기 때문에 GITC에서 BSA 표준물질을 만드는 것이 중요합니다. BSA 표준물질은 -20°C에서 무기한 보관할 수 있습니다.
2. 해동되고 잘 혼합된 세포 용해물과 BSA 표준물질 5μL를 분취하여 투명한 96웰 플레이트에서 웰을 분리합니다.
3. 각 웰에 195μL의 Bradford 시약을 추가하고 플레이트 리더에서 595nm(A₅₉₅)에서 흡광도를 측정합니다( 재료 표 참조).
공식
4. y = mx + b를 사용하여 BSA 표준 곡선과 비교하여 각 웰의 단백질 양을 계산합니다. 여기서 y는 A₅₉₅, x는 BSA의 μg, m은 표준 곡선의 기울기, b는 표준 곡선의 y-절편입니다. 결과 값에 0.05를 곱하여 각 샘플의 총 단백질 mg을 결정합니다.

3. 폴리인산염 추출

각

1. GITC 용해된 샘플에 95% 에탄올 250μL를 넣고 소용돌이쳐 혼합합니다.
2. 해당 혼합물을 실리카 멤브레인 스핀 컬럼에 적용하고 16,100 x g에서 30초 동안 원심분리합니다.
3. 플로우 스루를 버린 다음 750μL의 5mM Tris-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 50% 에탄올을 첨가하고 16,100 x g에서 30초 동안 원심분리합니다.
4. 플로우 스루를 버리고 16,100 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
5. 컬럼을 깨끗한 1.5mL 마이크로분리기 튜브에 넣고 150μL의 50mM Tris-HCl(pH 8)을 추가합니다.
6. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 8,000 x g.
   에서 2분 동안 원심분리하여 polyP를 용리합니다. 참고: 원하는 경우 용출액을 -20°C에서 최소 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

4. 폴리인산염 분해

1. 50mM Tris-HCl(pH 8)에서 0, 5, 50 또는 200μM 인산칼륨을 함유한 표준물질을 준비합니다.
   참고: 인산칼륨 표준물질은 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
2. 각 인산염 표준물질 및 추출된 polyP 샘플 100μL를 투명한 96웰 플레이트의 개별 웰에 분취합니다.
3. (샘플당): 5x ScPPX 반응 완충액 30μL(100mM Tris-HCl, 25mM MgCl₂, 250mM 암모늄 아세테이트, pH 7.5)13,_H2O 19μL 및 정제된 ScPPX(1mg mL-1) 1μL를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다.
4. 96웰 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 50μL를 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
   참고: 원하는 경우 소화된 polyP 샘플을 -20°C에서 무기한 보관할 수 있습니다.

5. 유리 인산염 검출

주석

1. 산안티몬칼륨 0.185g을 물 200mL에 녹인 후 4N H₂SO₄ 150mL를 첨가한 다음 헵타몰리브덴산암모늄 1.49g을 첨가하여 검출 용액 베이스를 준비합니다. 저어서 녹인 다음 최종 부피 456mL가 됩니다. 용액을 여과하여 미립자를 제거하고 최대 1개월 동안 4°C에서 빛으로부터 보호하여 보관합니다.
2. 1M 아스코르브산의 원액을 준비합니다. 최대 1개월 동안 4°C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
3. 검출 용액 베이스 9.12mL와 1M 아스코르브산 0.88mL를 혼합하여 매일 검출 용액의 신선한 작업 스톡을 준비합니다. 사용하기 전에 검출 용액이 실온에 도달하도록 하십시오.
4. 96웰 플레이트의 각 샘플과 표준물질에 검출 용액 50μL를 첨가하고 실온에서 약 2분 동안 배양하여 발색을 허용합니다.
5. 플레이트 리더로 882nm에서 흡광도를 측정하고 인산칼륨 표준 곡선과 비교하여 각 샘플의 인산염 농도를 계산합니다.
   주의: 검출 용액에는 독성 염과 강산이 포함되어 있습니다. 장갑을 착용하고 과도한 용액을 독성 폐기물로 처리하십시오.

6. 세포 폴리인산염 함량 계산

1. 다음 공식에 따라 5.5단계에서 결정된 인산염 농도를 각 전체 세포 용해물에서 폴리P 유래 인산염의 나노몰로 변환합니다:
   nmol polyP = 1.5 x (μM phosphate / 10)
   참고: 5단계의 표준 곡선 기반 방법은 4.2단계에서 분취된 각 100μL polyP 샘플에서 인산염의 농도(μM)를 결정합니다. 이 농도를 nmol 수로 변환하려면 100 μL을 10⁶으로 나누어 L의 부피를 얻고 농도(μmol ^L-1)를 곱한 다음 1,000(μmol의 nmol 수)을 곱합니다. 이것은 농도를 10으로 나누는 것으로 축소됩니다. 3단계에서 준비된 총 추출물 부피는 150μL이므로 전체 추출물에 존재하는 인산염의 nmol을 계산하려면 결과 값에 1.5를 곱해야 합니다.
2. 단계 1.4에서 결정된 각 샘플에서 nmol polyP를 총 단백질 mg으로 나누어 세포 polyP 함량을 총 세포 단백질로 정규화합니다. PolyP 수준은 개별 polyP 유래 유리 인산염의 농도로 표현됩니다.
   참고: 어떤 경우에는 샘플에 존재하는 polyP 유래 인산염의 양이 인산염 표준 곡선의 선형 범위를 벗어날 수 있습니다. polyP 수준이 매우 높은 경우, 필요에 따라 3.6단계의 과잉 polyP 함유 용출액을 1:10 또는 1:100으로 희석한 다음 4단계 내지 6에 설명된 대로 다시 측정할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
E. coli BL21(DE3)	Millipore Sigma	69450
LB 국물	Fisher Scientific	BP1427-2	대장균 성장 배지
암피실린	Fisher Scientific	BP176025
염화나트륨(NaCl)	Fisher Scientific	S27110
염화마그네슘(MgCl₂)	Fisher Scientific	BP214-500
Bradford 시약	Bio-Rad	5000205
Tris 완충액	Fisher Scientific	BP1525
염산(HCl)	Fisher Scientific	A144-212	트리스 완충 용액의 pH 조절용염
칼륨(KCl)	Fisher Scientific	P217500
글리세롤	Fisher Scientific	BP2294
10x MOPS 배지 혼합	Teknova	M2101	대장균 성장 배지
포도당	Fisher Scientific	D161
일염기성 인산칼륨(KH₂PO₄)	피셔 사이언티픽	BP362-500
이염기성 인산칼륨(K₂HPO₄)	피셔 사이언티픽	BP363-500
탈수 효모 추출물	피셔 사이언티픽	DF0886-17-0
트립톤	피셔 사이언티픽	BP1421-500
황산마그네슘 칠수화물	피셔 Scientific	M63-50
황산망간일수화물	Fisher Scientific	M113-500
구아니딘 이소티오시아네이트	Fisher Scientific	BP221-250
소 혈청 알부민(프로테아제 프리)	Fisher Scientific	BP9703100
투명 평평한 바닥 96웰 플레이트	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	모든 투명 96웰 플레이트가 작동합니다
Tecan M1000 Infinite 플레이트 리더	Tecan, Inc.	해당 없음	595 및 882nm에서 흡광도를 측정할 수 있는 플레이트 리더는 에
탄올	Fisher Scientific	04-355-451
실리카 멤브레인 스핀 컬럼 Epoch	Life Science	1910-050/250
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	Fisher Scientific	BP120500
1.5mL 마이크로푸지 튜브	Fisher Scientific	NC9580154
암모늄 아세테이트	피셔 사이언티픽	A637-500
안티몬 주석산 칼륨	피셔 사이언티픽	AAA1088922
4 N 황산(H₂SO₄)	피셔 사이언티픽	SA818-500
암모늄 엵타몰리브덴트	피셔 사이언티픽	AAA1376630
아스코르브산	피셔 사이언티픽	AC401471000

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