외막 소포로 전처리된 대식세포에서 Legionella pneumophila 복제 분석

초록

출처: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila 외막 소포: 대식세포에 대한 전염증 가능성의 분리 및 분석. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 박테리아 복제에 미치는 영향을 조사하기 위해 Legionella pneumophila 외막 소포(OMV)로 대식세포를 전처리하는 방법을 보여줍니다. 숙주 면역 신호를 변경함으로써 OMV는 대식세포를 감염에 더 쉽게 만듭니다. 처리되지 않은 세포에 비해 처리된 세포에서 더 높은 콜로니 수는 OMV가 대식세포 내부의 L. pneumophila 복제를 촉진한다는 것을 나타냅니다.

프로토콜

1. 대식세포 전처리

1. THP-1(도호쿠 병원 소아과-1 세포, 인간 단핵구 백혈병 세포주) 세포를 준비합니다.
   참고: THP-1은 백혈병 환자에서 유래한 단핵구 세포주입니다.
   1. 24웰당 2x10⁵ THP-1 세포를 추가하고 대식세포 유사 세포에 20nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 첨가하여 분화합니다. 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
   2. 배지를 500 μL의 신선한 배지로 교체하고 추가로 24시간 동안 배양하고, THP-1 세포에 대한 최적의 배지는 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 고포도당을 포함한다.
2. 쥐 골수 유래 대식세포(mBMDM)를 분리합니다.
3. THP-1 유래 대식세포 또는 mBMDM을 외막 소포(OMV)로 치료합니다.
   1. OMV를 해동하고 단백질 양(0.1, 1 및 10μg/mL)에 따라 인간 또는 쥐 대식세포에 추가합니다. 대식세포를 OMV와 함께 OMV와 함께 최소 20시간 동안 배양합니다.

2. 대식세포를 감염시키고 CFU(Colony-Forming Unit) 분석으로 박테리아 복제를 평가

합니다. 레

1. 지오넬라 뉴모필라, 4.3단계의 전처리된 THP-1 세포 또는 mBMDM을 사용하고 전처리된 대식세포를 대조군(2x10⁵/24 웰)으로 사용하지 않습니다. 매체를 교환하지 마십시오.
2. THP-1 세포를 L. pneumophila Corby WT 및 mBMDM에 L. pneumophila Corby의 플라젤린 결여 돌연변이체(둘 다 0.5의 감염 다중도(MOI); 1x10⁵ L. pneumophila/24 웰)로 감염시키고 각각 24시간 및 48시간 동안 배양합니다.
3. 사포닌(최종 농도: 0.1%)을 첨가하여 배지에서 세포를 용해하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
4. 피펫팅으로 박테리아를 재현탁하고 현탁액을 반응 용기로 옮깁니다. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 L. pneumophila 함유 배지의 연속 희석액을 준비합니다.
5. 완충 숯 효모 추출물(BCYE) 한천 플레이트에 필요한 희석액 50μL를 줄무늬로 만들고 37°C에서 3일 동안 배양합니다.
6. 형성된 식민지를 육안으로 세십시오. CFU

CFU 카운트 결과를 100%로 설정된 전처리되지 않았지만 감염된 대식세포로 정규화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 cm petridish	Sarstedt AG &; Co KG (Nuembrecht, Germany)	82.1473
활성탄	Carl Roth GmbH &; Co KG (Karlsruhe, Germany)	X865.2
한천, 고베 I	Carl Roth GmbH & Co KG(독일 카를스루에)	5210.2
양피 5% 함유 컬럼비아 한천	Becton Dickinson GmbH(독일 하이델베르크)	254005
질산철 비수화물	Carl Roth GmbH &; Co KG(독일 카를스루에)	5632.1
송아지 태아 혈청(FCS)	Technologies GmbH(독일 다름슈타트)	10270-106
Heracell 240i 이산화탄소 인큐베이터	Thermo Fisher Scientific Germany BV &; Co KG(브라운슈바이크, 독일)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific, Germany BV &; Co KG(브라운슈바이크, 독일)	75004515
접종 루프	Sarstedt AG &; Co KG(Nuembrecht, Germany)86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	Antje Flieger 교수(RKI, 베를린, 독일)L
. pneumophila Corby ΔflaA	------		Klaus Heuner 교수(RKI, 베를린, 독일)
mBMDM	---	---	Markus Schnare 교수(독일 마르부르크 필립스 대학교 마르부르크) 및 Carsten Kirschning 교수(독일 에센 뒤스부르크 대학교
PBS	Biochrom GmbH (독일 베를린)	L 1825
Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (독일 타우프키르헨)	P8139-1MG
회전식 셰이커 (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV &; Co KG (독일 브라운슈바이크)	SHKE6000
RPMI 1640 고포도당	Life Technologies GmbH (독일 다름슈타트)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH &; Co KG (독일 카를스루에)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (영국 케임브리지)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (독일 타우프키르헨)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV &; Co KG (독일 브라운슈바이크)
효모 추출물	Carl Roth GmbH &; Co KG (독일 카를스루에)	2363.2

Life , : ):