박테리아 수확 및 기계적 용해 절차

초록

출처: Mercier, N., et al. 그람 양성균에서 RNA 시퀀싱과 결합된 MS2-친화성 정제. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 박테리아 세포를 수확하고 기계적으로 용해하여 세포 내 내용물을 방출하는 단계별 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 박테리아 수확

주의: 이 단계에는 병원성 박테리아 취급이 포함됩니다.

1. 에리스로마이신(10μg/μL)이 보충된 BHI(Brain Heart Infusion) 배지 3mL에서 pCN51-P3-MS2-sRNA 또는 pCN51-P3-MS2 플라스미드를 운반하는 균주 콜로니 1
개를 성장시킵니다.
2. 에리스로마이신(10μg/μL)이 보충된 신선한 BHI 배지 50mL(≈1/100)에 각 하룻밤 배양액을 희석하여 OD_600nm 0.05에 도달합니다. 250mL 멸균 플라스크(플라스크 대 배지 비율 5:1)를 사용합니다.
   참고: 배지 및 성장 조건은 연구된 sRNA의 발현 패턴에 따라 설정되어야 합니다.
3. 37°C에서 180rpm에서 6시간 동안 흔들어 배양물을 배양합니다.
4. 각 배양액을 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
5. 4°C에서 15분 동안 2,900 x g으로 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
6. 펠릿을 얼음 위에 보관하고 기계적 세포 용해를 직접 수행하거나 펠릿을 -80°C에서 동결 및 보관합니다.

2. 기계적 세포 용해

주의: 다음 단계는 얼음 위에서 수행해야 하며 완충액은 4°C에 있어야 합니다. 장갑을 착용하고 RNase로부터 샘플을 보호하기 위해 모든 예방 조치를 취하십시오.

펠

1. 릿(단계 1.6)을 5mL의 완충액 A(150mM KCl, 20mM Tris-HCl pH 8, 1mM MgCl₂ 및 1mM DTT)에 재현탁합니다.
2. 재현탁된 세포를 3.5g의 실리카 비드(0.1mm)와 함께 15mL 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
3. 기계식 세포 용해 기기에 튜브를 삽입합니다. 40m/s에서 4.0초 사이클을 실행합니다.
   참고: 한 사이클이 세포를 깨뜨리기에 충분하지 않은 경우 샘플을 얼음 위에 보관하면서 장치를 5분 동안 식히십시오. 그런 다음 40m/s에서 4.0초의 또 다른 주기를 반복합니다. 세포 용해의 효율은 BHI-한천 플레이트에 상청액을 도금하여 테스트할 수 있습니다.
4. 15,700 x g에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 회수하여 얼음 위에 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 원심분리기 튜브	Falcon	352070
50 mL 원심분리기 튜브	Falcon	352051
250 mL 배양 플라스크	Dominique Dutscher	2515074	박테리아 배양
BHI(뇌 심장 주입) 국물	Sigma-Aldrich	53286	성장 배지
에리스로마이신(ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	성장 배지
용해 매트릭스 B 벌크	MP Biomedicals	6540-428	기계적 용해
RNAPro 솔루션	MP Biomedicals	6055050	기계적 용해
FastPrep 장치	MP Biomedicals	116004500	기계적 용해
분광 광도계 Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	박테리아 배양