친화성 정제를 사용한 작은 조절 RNA 결합 박테리아 표적 RNA 분리

초록

출처: Mercier, N., et. al., 그람 양성균에서 RNA 시퀀싱과 결합된 MS2-친화성 정제. J. Vis. 경험. (2021년)

이 비디오는 아밀로스 수지에 고정된 맥아당 결합 단백질(MBP)-MS2 코트 단백질 융합을 사용한 친화성 정제를 사용하여 박테리아 표적 RNA에 결합된 MS2 태그 소규모 조절 RNA(sRNA)를 분리하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

완충액 및 배지

MAPS 실험의 경우 다음 완충액 및 배지를 준비합니다.- 완충액 A(150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT)- 완충액 E(250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM 맥아당, 0.1% Triton, 1 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT)

컬럼 준비

주의: 아밀로스 수지가 마르지 않도록 주의하십시오. 필요한 경우 엔드 캡으로 컬럼을 밀봉합니다. 친화성 정제를 시작하기 전에 모든 용액을 준비하십시오.

1. 크로마토그래피 컬럼을 컬럼 랙에 넣습니다.
2. 컬럼 팁을 제거하고 초순수로 컬럼을 세척합니다.
3. 300μL의 아밀로스 수지를 첨가합니다.
4. 10mL의 완충액 A로 컬럼을 세척합니다.
5. MBP(맥아당 결합 단백질)-MS2 단백질 1,200pmol을 6mL의 완충액 A에 희석하고 컬럼에 로드합니다.
6. 10mL의 완충액 A로 컬럼을 세척합니다.

MS2-친화성 정제(그림 1)

1. 세포 용해물을 컬럼에 로드합니다.
   참고: 총 RNA를 추출하고 노던 블롯 및 전사체 분석을 수행하기 위해 세포 용해물(조 추출물, CE) 1mL를 보관합니다.
2. 깨끗한 수집 튜브에 유동 분획(FT)을 수집합니다.
3. 10mL의 완충액 A로 컬럼을 3회 세척하고 세척 분획(W)을 수집합니다.
4. 1mL의 완충액 E로 컬럼을 용리하고 용출 분획(E)을 2mL 마이크로튜브에 수집합니다.
5. 수집된 모든 분획은 RNA 추출이 될 때까지 얼음 위에 보관하거나 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에서 냉동합니다.

결과

그림 1. 황색포도상구균에 적용된 MAPS 프로토콜의 개략도. 플라스미드 구성부터 데이터 분석까지.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 미세 원심분리기 튜브	Sarstedt	72.690.001
15 mL 원심분리기 튜브	Falcon	352070
2 mL 미세 원심분리기 튜브	Starstedt	72.691
250 mL 배양 플라스크	Dominique Dutscher	2515074	박테리아 배양
50 mL 원심분리기 튜브	Falcon	352051	배양 원심분리
아밀로스 수지	New England BioLabs	E8021S	MS2 친화성 정제
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP 생산
Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼	BioRad	7311550	MS2 친화성 정제