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1. 박테리아 균주 또는 돌연변이 라이브러리의 준비
1. 적절한 한천 플레이트에서 테스트할 균주를 줄무늬로 줄지어 만듭니다. 이들은 실험을 위한 스톡 플레이트입니다.
1. 단일 콜로니를 얻기 위해 원하는 온도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 이 실험을 위해 K. pneumoniae(NTUH-K2044 및 ATCC43816 균주)를 Luria 국물(LB) 한천에서 37°C에서 배양하고 S. pneumoniae(23F 야생형 및 23F Δcps)를 37°C의 가습 양초병에 혈액 한천에 배양합니다.
2. 스톡 플레이트(단계 1.1)에서 단일 콜로니를 선택하여 멸균 루프 또는 칵테일 스틱을 사용하여 적절한 국물 10mL를 접종합니다. 무작위 돌연변이 라이브러리의 스크리닝을 위해 국물에 무작위 돌연변이 라이브러리 스톡 10μL(TraDIS 라이브러리)를 접종합니다.
1. K. pneumoniae 균주를 37°C의 저염 LB 배지에서 흔들면서 배양하고, S. pneumoniae 균주를 뇌심장 주입(BHI) 배지에서 37°C에서 정적으로 배양합니다.
2. 하룻밤 배양액을 15mL 튜브로 옮기고 벤치탑 원심분리기에서 15mL 튜브 인서트와 에어로졸 단단한 뚜껑이 있는 스윙 아웃 버킷에서 3,200 x g으로 10분 동안 원심분리합니다.
3. 상청액을 버리고 펠릿을 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 2mL에 재현탁합니다.
참고: 실험실에서 적절한 액체 생물학적 폐기물 경로를 통해 상청액을 폐기하십시오. 원심분리 및 재현탁 단계(1.2.2 및 1.2.3)의 목적은 구배에서 쉽게 시각화할 수 있도록 박테리아를 농축하는 것입니다. 원하는 경우 박테리아 배양물을 구배에 직접 로드할 수 있습니다. 심하게 캡슐화된 균주는 단단한 펠릿을 형성하지 않을 수 있습니다. 이 경우 박테리아 세포를 제거하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 제거하고 최종 부피 5mL에 1x PBS를 첨가한 다음 펠릿을 재현탁합니다. 1.2.5단계로 프로토콜을 계속합니다.
5. 1.2.2단계에 설명된 대로 튜브를 원심분리합니다.
6. 상청액을 버리고 펠릿을 2mL의 1x PBS에 재현탁합니다. 이제 셀을 사용할 준비가 되었습니다.
참고: 박테리아 세포 현탁액의 밀도는 critica,l이 아니지만 그라디언트에서 시각화하기에 충분해야 합니다. 최소 OD600(600nm에서의 광학 밀도)은 4가 제안됩니다.