불연속 밀도 구배를 이용한 캡슐 양에 의한 박테리아 분리

초록

출처: Feltwell, T., et.al. 불연속적인 밀도 구배를 사용하여 캡슐 양으로 박테리아를 분리합니다. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 캡슐 양에 따라 박테리아 균주를 분리하기 위해 불연속적인 밀도 구배를 사용하는 방법을 보여줍니다. 구배를 통해 트랜스포존 돌연변이 라이브러리를 원심분리함으로써 캡슐 밀도가 다른 박테리아가 별개의 층에 국한됩니다. 그런 다음 다운스트림 분석을 위해 분리된 분획을 수집할 수 있습니다.

프로토콜

1. 준비된 세포를 그래디언트에 첨가하고 원심분리에 의한 분리

1. 준비된 세포 600μL를 튜브의 그래디언트 상단에 매우 천천히 그리고 계면을 혼합하지 않고 추가합니다.
2. 튜브를 튜브 어댑터에 넣고 결합된 어댑터와 튜브의 무게를 측정하여 균형이 맞는지 확인합니다.
   1. 벤치탑 원심분리기 내의 고정각 로터에 튜브 어댑터를 놓습니다. 3,000 x g에서 30분 동안 원심분리합니다.
   2. 원심분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 적절한 랙에 놓고 결과를 기록으로 사진으로 찍습니다.
3. 우론산 정량 또는 DNA 추출을 위해 박테리아 분획을 회수합니다.
   1. 다운스트림 적용이 필요하지 않은 경우 실험실에서 적절한 액체 생물학적 폐기물 경로를 통해 샘플/그래디언트를 폐기하십시오.
      참고: 새로운 박테리아 종/균주에 대한 분리를 검증하는 것이 중요합니다. 구배의 개별 분획은 현미경, 우론산 분석 또는 각 분획의 캡슐 표현형을 확인하기 위해 다른 적절한 정량 분석으로 검사해야 합니다. 응집 또는 세포 크기에 따라 분리하는 것이 목표인 경우 독립적인 적절한 분석을 사용해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
로터 A-4-81 및 500ml 버킷이 있는 원심분리기 5810R	Eppendorf	5810 718.007
15ml 튜브용 어댑터	Eppendorf	5810 722.004
고정각 로터 F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2.6 - 7 ml 튜브 어댑터	Eppendorf	5804 739.000
로터 FA-45-24-11 Eppendorf 5424		000.460
5ml 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브	Falcon	352063

포함