1. 대장균에서 럭스 오페론의 설계, 준비 및 발현
참고: 이 섹션에서 사용되는 상용 키트에 대한 정보는 재료 표를 참조하십시오.
- 럭스 오페론을 대장균으로 전달하려면 적절한 제한 부위와 관심 있는 항생제 내성 유전자(예: pET28a; NcoI, XhoI, 카나마이신).
- Photobacterium mandapamensis 27561(GenBank: DQ988878.2)의 DNA 서열을 기반으로 Gibson 조립을 위한 단편 및 중첩 프라이머를 설계합니다.
- 설계된 프라이머와 Photobacterium mandapamensis 27561의 분리된 게놈 DNA(데옥시리보핵산)를 주형으로 사용하여 표준 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응을 설정합니다.
참고: 각 박테리아 균주의 게놈 DNA를 분리하면 PCR 효능이 향상됩니다. - 스핀 컬럼 정제를 통해 PCR 산물을 정제합니다.
- 37°C에서 45분 동안 NcoI 및 XhoI로 분리된 pET28a 벡터의 제한 분해를 수행합니다.
- 아가로스 겔 전기영동 및 후속 스핀 컬럼 정제를 통해 선형화된 벡터와 PCR 단편을 정제합니다.
- 각 단편과 선형화된 벡터의 DNA 농도를 결정하고 프로토콜에 따라 조립을 위한 최적의 양을 계산합니다.
참고: 조립의 효능은 단편 크기와 수에 따라 달라지며 제조업체의 프로토콜에 따라 조정해야 합니다. - PCR 튜브에서 모든 단편과 완충액을 결합한 후, PCR 기계에서 50°C에서 1시간 동안 어셈블리 혼합물을 배양합니다.
대- 장균 박테리아 플라스미드 형질전환을 위한 표준 형질전환 프로토콜에 따라 조립된 벡터 산물을 고수율 플라스미드 복제를 위한 적절한 대장균 시스템(예: 대장균 TOP10 또는 XL-1)으로 형질전환합니다.
- 형질전환 플레이트에서 콜로니를 선택하고 DNA 분리를 위해 새 플레이트에 줄무늬를 그립니다.
- 표준 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 분리합니다.
- 모든 단편을 포함하여 플라스미드의 올바른 조립을 확인하려면 먼저 조립된 모든 단편에 특이적인 프라이머를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 콜로니 PCR을 수행합니다.
- 콜로니 PCR 및 후속 아가로스 겔 전기영동에 추가로 DNA 시퀀싱을 위해 분리된 모든 어셈블리 벡터를 준비하여 올바른 어셈블리와 올바른 DNA 서열을 확인합니다.
대 - 장균 박테리아 플라스미드 형질전환을 위한 표준 형질전환 프로토콜에 따라 검증된 플라스미드를 고수율 단백질 생산을 위한 적절한 대장균 시스템(예: 대장균 BL21)으로 형질전환합니다.
참고: 아래의 발현 프로토콜을 직접 계속하십시오. 장기간 보관하려면 글리세롤 스톡을 준비하는 것이 좋습니다.
2. 변형된 대장균 균주의발현
- 조립된 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21 세포의 이전에 준비된 글리세롤 스톡으로 적절한 부피의 Luria-Bertani(LB) 배지(예: 100mL)를 접종하거나 형질전환 플레이트에서 직접 접종하여 발현을 위한 하룻밤 배양(ONC)을 준비합니다. 100μL의 카나마이신(50mg/mL, pET28a의 항생제 내성 유전자)을 첨가하고 ONC를 인큐베이터 셰이커에서 밤새 37°C 및 120rpm에서 배양합니다.
- 주요 발현 배양액(예: LB 배지 800mL)에 ONC 8mL를 접종하고 카나마이신 800μL(50mg/mL)를 첨가합니다.
- 세포 밀도가 0.6 - 0.8(약 2.5시간)의 OD600에 도달할 때까지 인큐베이터 셰이커에서 37°C 및 120rpm에서 메인 배양
물을 배양합니다.- 배양 온도를 28°C로 낮춥니다.
- 프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.1mM의 최종 농도에 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다.
참고: 실증적 테스트에서 온도를 28°C로 낮추면 가장 높은 광도가 나타났습니다. - 세포가 빛나기 시작할 때까지(약 1시간) 관찰합니다.
참고: 발현 목적에 따라 세포를 다음날까지 성장시킨 후 수확하거나 세포가 빛나는 동안(최대 48시간) 계속 흔들릴 수 있습니다. 세포 채취 및 단백질 정제는 표준 절차에 따라 수행할 수 있습니다.
3. 박테리아 생물발광 균주의 발현
참고: 박테리아 생물발광 균주는 성장 및 빛 생산을 위해 특정 성장 배지/인공 해수 배지가 필요합니다.
- 별도로 준비된 두 가지 배지 성분으로 구성된 인공 해수 배지를 준비합니다. />참고: 다음 양은 액체 배지 1L 또는 한천 배지 1L에 대한 것입니다.
- 인공 해수 배지의 경우 다음 염으로 무게를 측정합니다: NaCl(염화나트륨) 28.13g, KCl(염화칼륨) 0.77g, CaCl2 · 2H2O 1.60g(염화칼슘 이수화물), MgCl2 · 6H2O 4.80g(염화마그네슘 육수화물), NaHCO3 0.11g(중탄산나트륨) 및 MgSO4 ·7H2O(황산마그네슘 칠수화물) 3.50g
.증- 류수 1L를 넣고 모든 성분을 녹입니다.
- LB 배지의 경우 효모 추출물 10g, 펩톤 10g, 한천 플레이트의 경우 한천 20g을 추가
로 함량합니다.- 수돗물 250mL를 넣고 성분을 녹입니다.
- 준비된 두 배지를 121°C에서 20분 동안 따로 오토클레이브합니다.
- 한천 플레이트의 경우 고압멸균 직후 LB 배지 250mL와 인공 해수 배지 750mL를 결합하고 플레이트를 준비합니다.
- 액체 배지의 경우, 250mL의 LB 배지와 750mL의 인공 해수 배지를 고압멸균 직후 또는 냉각할 때 결합합니다.
참고: 인공 해수 배지는 염분 침전을 통해 탁해질 수 있습니다.
- 박테리아 생물발광 균주를 인공 해수 배지 한천 플레이트에 줄무늬로 만들고 24 - 30 °C에서 밤새 배양합니다.
참고: 박테리아 균주의 장기간 보관은 일반적으로 박테리아 배양의 글리세롤 스톡을 동결함으로써 달성됩니다. 해동 후 성장의 지연 단계로 인해 액체 배양에 사용하기 전에 모든 균주에 대해 균일한 시작 조건을 보장하기 위해 균주는 항상 한천 플레이트에 먼저 줄무늬를 남겨야 합니다. - 100mL의 인공 해수 배지에 플레이트의 단일 콜로니를 접종하여 ONC를 준비합니다. ONC를 인큐베이터 셰이커에서 24 - 30 °C 및 120 rpm에서 밤새 배양합니다.
- 800mL의 인공 해수 배지에 8mL의 ONC를 접종합니다.
- 인큐베이터 셰이커에서 박테리아 세포를 24 - 30 °C 및 120 rpm에서 배양합니다.
참고: 생물발광 박테리아의 광도 프로파일은 온도에 따라 크게 변합니다. 각 박테리아 균주의 빛 생성의 조절 메커니즘에 따라 약 1 - 6시간 후에 빛 방출이 시작될 수 있습니다. - 박테리아 세포 배양이 빛나기 시작할 때까지(약 1 - 6시간) 관찰합니다.
참고: 발현의 목적에 따라 세포를 다음날까지 성장시킨 후 수확하거나 세포가 빛나는 동안 계속 흔들릴 수 있습니다. 세포 채취 및 단백질 정제는 표준 절차에 따라 수행할 수 있습니다.
4. 박테리아 생물발광 균주 및 변형된 대장균 균주에 대한 생체 내 활성 분석
참고: 균주의 장기간 보관은 일반적으로 박테리아 배양의 글리세롤 스톡을 동결하여 달성됩니다. 해동 후 성장의 지연 단계로 인해 액체 배양에 사용하기 전에 모든 균주에 대해 균일한 시작 조건을 보장하기 위해 균주는 항상 한천 플레이트에 먼저 줄무늬를 남겨야 합니다.
- 원하는 생물발광 박테리아 균주 또는 변형된 대장균 균주를 한천 플레이트에 줄무늬로 만들고 28°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 배양 온도는 균주마다 다를 수 있으며 경험적으로 평가해야 합니다. 생물발광 박테리아 균주와 변형된 대장균 균주를 비교할 수 있으려면 성장 조건이 동일해야 합니다. - 한천 플레이트에서 단일 콜로니로 각 균주와 함께 배지 3mL를 접종하고 인큐베이터 셰이커에서 약 1 - 2시간 동안 세포를 28°C 및 180rpm에서 배양합니다.
- 650nm에서 액체 배양액의 1:10 희석액의 세포 밀도를 측정합니다. OD650이 0.05.
인 1mL 배양의 비율과 부피를 계산합니다. 참고: 후속 플레이트 리더 분석은 균주의 발광에 의한 간섭을 피하기 위해 650nm에서 세포 밀도를 결정합니다. - 계산된 배양 및 배지의 부피를 유리 바닥이 있는 24웰 검은색 벽 플레이트에 피펫팅합니다. 변형된 대장균 균주의 경우, 1 μL의 카나마이신(pET28a 벡터의 항생제 내성) 및 1 μL의 IPTG(유전자 발현 유도)를 샘플에 첨가합니다. 측정 중 증발을 방지하기 위해 플레이트에 뚜껑을 덮으십시오.
참고: 전체 럭스 오페론을 포함하는 pET28a 벡터가 대장균 배양에 의해 손실되지 않도록 하려면 플레이트 웰의 각 대장균 샘플에 카나마이신을 첨가하고 대장균 세포의 빛 생산을 측정할 수 있도록 해야 합니다. 유전자 발현은 IPTG에 의해 유도되어야 합니다. 누화 및 측정 간섭을 피하기 위해 유리 바닥과 투명한 뚜껑이 있는 검은색 벽 웰 플레이트가 최상의 결과를 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고 누화를 관찰할 수 있으며 우물 위치를 신중하게 선택해야 합니다. - 플레이트 리더에서 측정을 시작합니다.
참고: 플레이트 리더 프로토콜은 흡광도와 생물발광이라는 두 가지 측정을 결합한 이 분석을 위해 특별히 개발된 스크립트를 기반으로 합니다. 데이터 포인트는 10분마다 수집되며 측정 사이에 영구적인 흔들림과 28°C의 일정한 온도가 있습니다.
