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1. MIC 패널 희석액 준비
- 멸균 유리 또는 플라스틱 튜브에 순수한(순수한) 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 1,600 μg/mL 이하의 달바반신 원액을 준비하고 준비 당일에 사용하거나 향후 해동되지 않는 냉동고에서 사용할 수 있도록 -20 내지 -60 °C 이하에서 보관합니다. 분말의 무게를 측정할 때 분말과 함께 받은 문서에 제공된 달바반신의 효능을 고려하십시오.
- 멸균 유리 또는 플라스틱 튜브에 깔끔한 DMSO를 사용하는 방식과 유사하게 스톡 희석액을 희석합니다. 희석액을 측정하기 위해 하나의 피펫을 사용하고 첫 번째 튜브에 초기 dalbavancin 스톡을 추가하기 위해 다른 피펫을 사용합니다. 이후의 각 달바반신 스톡 농도에 대해 새 피펫을 사용하십시오.
- 순수한 DMSO로 100X 최종 MIC 패널 농도 희석액(중간 농도)을 준비합니다. 원하는 중간 농도를 달성하기 위해 적절한 양의 소스와 DMSO를 결합합니다(사용할 양은 만들 MIC 패널의 수에 따라 다름).
- 0.004% P80 준비: 4.9mL dH₂O에 0.1mL P80을 첨가하여 2% P80의 신선한 작업 원액을 준비합니다. 0.22μm 필터를 통과하여 멸균하고 준비 당일에 용액을 사용합니다. 2% P80의 1:500 희석액을 만들어 0.004% P80 희석제를 준비합니다(예: 0.3mL의 2% P80 내지 149.7mL의 CAMHB).
- 또한, 접종물을 첨가하면 1:2 희석이 발생하기 때문에 최종 농도의 두 배로 0.004%(v/v) 폴리소르베이트-80(P-80) 및/또는 LHB(연쇄상 구균용)가 첨가된 양이온 조정 뮬러 힌튼 국물(CAMHB)에서 중간 농도를 1:100으로 희석합니다.
2. MIC 패널 준비 준비된
- 각 달바반신 용액 50μL를 MIC 패널의 적절한 웰에 분배하고 하나의 웰(성장 조절 웰)에만 배지를 포함합니다. 이 단계에는 멸균 팁이 있는 다중 채널 피펫을 사용할 수 있습니다.
- 패널을 즉시 사용하거나 플라스틱 필름으로 밀봉하여 비닐 봉지에 담은 다음 필요할 때까지 즉시 ≤ -20°C(바람직하게는 ≤ -60°C)의 해동되지 않는 냉동고에 넣으십시오. 냉동 패널을 사용하는 경우 패널 접종을 진행하기 전에 씰을 제거하고 개별 패널을 실험실 벤치에 15-30분(웰 내용물이 해동될 때까지) 놓습니다.
3. MIC 패널 접종, 순도 수행 및 콜로니 수 설정
- 18-24시간 혈액 한천 또는 기타 비선택적 한천 플레이트에서 잘 분리된 여러 콜로니를 선택합니다. 멸균 루프 또는 면봉으로 각 콜로니의 상단을 만지고 탁도가 0.5 McFarland 표준과 동일해질 때까지 1-5mL CAMHB 또는 식염수로 옮깁니다. 0.5 McFarland와 육안으로 비교하거나 광도 측정 장치를 사용하여 탁도를 평가합니다.
- 준비 후 15-30분 이내에 접종물을 CAMHB에서 1:100으로 희석합니다(100μL를 10mL CAMHB에 ). S. pneumoniae를 제외하고 dalbavancin에 대해 테스트된 대부분의 박테리아의 경우 이 희석액은 5 × 10⁵ CFU/mL의 최종 웰 농도를 제공합니다(허용 범위는 2-8 × 10⁵ CFU/mL). S. pneumoniae의 경우, 탁도와 0.5 McFarland의 비교를 기반으로 한 박테리아 농도는 일반적으로 상당히 낮습니다. 따라서 접종물을 1:25로 희석합니다(400μL를 10mL CAMHB + 10% LHB로).
- 접종물 준비 후 15분 이내에 최종 접종물 50μL를 준비된 MIC 패널의 각 웰(무균 제어 웰 제외)으로 옮깁니다. 이 단계에는 멸균 팁을 사용하는 다중 채널 피펫을 사용할 수 있습니다.
- 멸균 루프를 사용하여 양성 성장 대조군 웰에서 1-10 μL 분취량을 비선택적 한천(예: 5% 양 혈액이 함유된 트립티카제 대두 한천)으로 옮기고 퍼뜨려 순도 검사를 수행합니다.
- 단일 채널 피펫과 멸균 팁을 사용하여 성장 대조군 웰에서 10 μL를 제거하고 식염수 10 mL(1:1,000 희석)로 옮겨 콜로니 수를 설정합니다. 단일 채널 피펫과 멸균 팁으로 100μL를 혼합하여 적절한 비선택적 한천 배지(예: 5% 양의 혈액이 함유된 트립티카제 대두 한천)에 옮기고 멸균 루프로 전체 한천 표면에 퍼뜨리고 접종물의 균일한 분포를 보장하기 위해 다른 방향으로 두 번 반복합니다(1:10 희석).
4. MIC 패널, 콜로니 수 및 순도 플레이트 배양
배
- 양하기 전에 플라스틱 테이프 또는 꽉 끼는 플라스틱 덮개로 비닐 봉지에 각 MIC 패널 또는 4개 이하의 패널 스택을 밀봉합니다. 또는 4개 이하의 MIC 패널 스택 상단에 빈 MIC 패널을 놓고, 젖은 종이 타월을 플라스틱 용기에 넣고 MIC 패널을 플라스틱 용기에 넣은 다음 뚜껑으로 용기를 단단히 닫습니다. 접종 후 30분 이내에 35°C ± 2°C의 주변 공기 인큐베이터에서 16-20시간(포도상구균 및 장구균) 및 20-24시간(연쇄상 구균) 동안 MIC 패널을 배양합니다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 연쇄상 구균을 배양하는 것을 제외하고 동일한 조건에서 콜로니 카운트 및 순도 플레이트를 배양합니다.
5. MIC 및 콜로니 카운트 플레이트를 읽습니다. 순도 확인판
- MIC를 육안으로 감지한 웰에서 박테리아 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 농도로 읽으십시오.
- 콜로니 카운트 플레이트의 콜로니 카운트. 각 콜로니에 희석 계수(1:10,000)를 곱합니다(예: 50 콜로니는 5 × 10⁵ CFU/mL에 해당). 허용 가능한 범위는 20-80 콜로니(2-8 × 10⁵ CFU/mL)이며 대략적인 지침으로 사용됩니다.
- 순도판을 확인하십시오. 모든 식민지가 각 식민지와 유사하면 접종물은 순수한 것으로 간주될 수 있습니다. 다른 콜로니가 있는 경우 MIC 패널에 오염 물질이 존재할 가능성이 있으므로 테스트를 반복해야 합니다.