세균에 감염된 세포에서 엔도-리소좀 리모델링의 나노입자 매개 시각화

초록

출처: Zhang, Y., et al. 세포내 박테리아에 의한 엔도-리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위한 형광 나노입자의 적용. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오는 세포내 박테리아에 감염된 인간 상피 세포에서 엔도-리소좀 리모델링을 시각화하기 위해 형광 나노입자를 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 침입 후 병원체는 숙주 세포골격과 엔도-리소좀 시스템을 조작하여 소포 수송을 변경하는 관형 돌출부가 있는 액포를 형성합니다. 그런 다음 형광 표지된 나노입자를 사용하여 이러한 변화를 추적하여 병원체 유발 세포내 트래피킹 사건의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

프로토콜

1. HeLa 세포의 배양
   1. LAMP1-GFP(리소좀 관련 막 당단백질 1-녹색 형광 단백질)를 영구적으로 발현하는 HeLa 세포를 Dulbecco의 변형 독수리 배지 또는 10% 송아지 태아 혈청(FCS)이 포함된 DMEM에서 배양하고 5% CO₂를 포함하는 분위기에서 37°C에서 성장시킵니다.
   2. 8웰 챔버 슬라이드(Ibidi)에서 웰당 50,000의 밀도로 세포를 시드하고 하룻밤(O/N)에 배양합니다.
2. Culture of Bacteria
   1. 살모넬라 엔테리카 혈청형 Typhimurium NCTC 12023 야생형(WT) 균주를 사용합니다. 비교를 위해 SPI2-T3SS에서 결함이 있는 돌연변이 균주 ΔssaV 및 SIF용 핵심 이펙터 SifA가 없는 ΔsifA를 사용합니다. 향상된 GFP의 구성적 발현을 위해 플라스미드 pFPV25.1을 포함하는 균주를 사용하십시오.
      참고: 박테리아 균주는 플라스미드를 유지하는 데 필요한 50μg/ml 카르베니실린(WT) 및 LB를 첨가하여 50μg/ml 카르베니실린(WT) 및 LB를 첨가하여 루리아-베르타니 국물(LB)에서 일상적으로 배양됩니다.
   2. 3ml LB에 박테리아의 단일 콜로니에 적절한 항생제를 접종하고 폭기를 위해 진탕 조건에서 37ºC에서 O/N을 성장시킨 다음 신선한 LB에서 1:31로 희석하고 3.5시간 동안 계속 성장시킵니다. 이 시점에서 배양은 후기 로그 단계에 도달하고 박테리아는 매우 침습적입니다. '롤러 드럼'은 폭기와 함께 시험관 배양을 배양하는 데 편리합니다.
3. 살모넬라 및 금-BSA-로다민 나노입자 또는 NPs 펄스 체이스 라벨링에 의한 HeLa 세포 감염(체계는 그림 1 참조)
   1. 계대배양된 박테리아의 OD₆₀₀을 측정하고 1ml 인산염 완충 식염수 또는 PBS(~3 × 10⁸ cfu/ml), 8웰 챔버 슬라이드의 HeLa 세포에 적절한 양의 박테리아를 추가하여 100의 감염 다중도(MOI)를 달성합니다.
   2. 세포 인큐베이터에서 30분 동안 배양하고 PBS로 3회 세척하여 내재되지 않은 박테리아를 제거합니다(이 시점은 감염 후 0시간 또는 0시간 p.i.로 설정됨). 100 μg/ml 겐타마이신을 함유한 신선한 배양 배지 300 μl를 넣고 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 나머지 배양 시간 동안 10μg/ml 겐타마이신을 함유한 신선한 배지로 배지를 교체합니다.
   3. 100μg/ml 겐타마이신을 함유한 배양 배지와 1시간 동안 배양한 후, 배지를 10μg/ml 겐타마이신을 함유한 이미징 배지(FCS, L-글루타민, 페놀 레드 및 중탄산나트륨이 없는 Eagle's MEM, 30mM HEPES, pH 7.4)로 대체합니다. 금-BSA-로다민 NP를 HeLa 세포에 첨가하여 OD₅₂₀ = 0.1의 최종 농도를 얻습니다. (소 혈청 알부민 또는 BSA)
      참고: 금-BSA-로다민 NP는 감염 전 또는 다양한 시점 p.i.에서 세포에 첨가될 수도 있습니다.
   4. 1시간 배양 후, 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 나머지 배양 시간 동안 10% FCS 및 10μg/ml 겐타마이신을 함유한 신선한 이미징 배지 300μl를 첨가합니다.
      참고: 배양 기간은 사용된 NP 및 세포주의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. RAW264.7 대식세포의 경우, OD₅₂₀ = 0.05의 농도에서 NP와 30분 동안 배양하면 충분한 내재화가 가능

하다는 것을 관찰했습니다.

결과

그림 1. 살아있는 세포 이미징을 위한 HeLa 세포 준비 계획. HeLa 세포를 챔버 슬라이드에 파종하거나, 모의 감염시키거나, 다양한 살모넬라 균주에 30분 동안 감염시킨 후 PBS로 3회 세척한 후 100μg/ml 겐타마이신을 함유하는 배지와 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 10nm 금-BSA-로다민 NP(OD₅₂₀ = 0.1) 및 10μg/ml 겐타마이신을 함유한 이미징 배지로 교체...

재료