철분 제한 조건에서 결핵균 배양

초록

출처: Gupta, S., et al. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 철분 제한 조건에서 결핵균 을 배양하여 철분 스트레스를 유도하고 박테리아 생존을 지원하는 시데로포어의 분비를 촉진하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 철분 제한 조건에서 마이코박테리아 성장

1. Mtb(결핵균) 의 냉동 15% 글리세롤 스톡 50μL를 해동하고 10% ADN(알부민 – 포도당 – NaCl) 농축(알부민 5g/L, 포도당 2g/L 및 염화나트륨 0.85g/L, 글리세롤 0.2% 및 0.05% Tween-80)이 보충된 한천 플레이트를 줄무늬로 만듭니다. 콜로니가 보일 때까지 플레이트를 37°C에서 배양합니다.
2. ADN 농축이 보충된 2mL의 마이코박테리아 국물 배지(재료 표)에 Mtb의 단일 콜로니를 접종합니다. 37°C에서 교반하면서 배양합니다.
3. Mtb 배양액이 후기 로그 단계(OD₅₄₀ 은 ~0.8)까지 성장하도록 합니다. 이를 확인하려면 분광 광도계를 사용하여 OD₅₄₀ 을 측정하십시오.
4. 후기 로그 배양액 200μL를 0.2% 글리세롤, 0.05% Tween-80 및 ADN이 보충된 마이코박테리아 한천 플레이트(재료 표)에 퍼뜨립니다. 최소 5개의 플레이트를 접종합니다. 박테리아 성장이 합류 층으로 보일 때까지 플레이트를 37°C에서 배양합니다. Mtb의 경우 ~1주일이 소요됩니다.
5. 멸균 면봉을 LIMM(저철분 최소 미디엄)에 적십니다. 이 면봉을 사용하여 한천 플레이트에서 박테리아를 수집하고 100mL의 LIMM을 접종하여 OD₅₄₀ 이 ~1.0인 농축 박테리아 현탁액을 준비합니다.
6. 이 현탁액을 LIMM으로 1L로 10배 희석하고 각각 500mL의 배양액이 들어 있는 2L 멸균 플라스틱 병 2개로 나눕니다.
7. 배양액 2mL를 꺼내 5mL 배양 튜브로 옮깁니다. 10 μL의 10% vol/vol tyloxapol을 첨가합니다.
8. 배양액을 37°C에서 14일 동안 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미들브룩 7H10 한천	BD 디프코	262710	마이코박테리아 한천 플레이트
미들브룩 7H9 국물	BD 디프코	271310	마이코박테리아 국물 배지
폴리프로필렌 얇은 벽 원심분리기 튜브 13x15mm	베크만 쿨터	344059	폴리프로필렌 얇은 벽 원심분리기 튜브 13x15mm
진공 여과 플라스크	셀프로	V50022	필터 유닛