Mycobacterium tuberculosis에서 Siderophore 함유 세포외 소포의 분리

초록

출처: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 숙주 환경을 모방하는 철분 제한 조건에서 배양된 Mycobacterium tuberculosis 에서 세포외 소포(EV)를 단계적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. EV 함유 분획을 농축하고 식별하기 위해 한외여과, 차등 원심분리 및 밀도 구배 분리를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 마이코박테리아 세포외 소포(MEV) 수집

1. 수집 시 2mL 배양액의 OD₅₄₀ 을 측정합니다. 배양액을 1:10 연속 희석하고 ADN 및 0.05% Tween-80으로 한천 플레이트에 각 희석액 100μL를 플레이트합니다.
2. 배양액을 5개의 225mL 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 20°C에서 7분 동안 2,850 x g 으로 원심분리합니다.
3. 50mL 피펫으로 배양 상청액을 수집하고 0.22μm 필터 장치를 통해 필터 멸균합니다.

2. MEV의 격리

1. 배양 여과액을 4°C에 놓인 교반 세포 한외여과 시스템으로 옮기고 100kDa 차단막을 통해 <50psi에서 농축액을 ~50mL까지 여과합니다.
2. 농축된 배양 여과액을 15,000 x g 으로 4°C에서 15분 동안 원심분리하고 상청액을 수집합니다.
3. 폴리카보네이트 초원심분리 튜브에서 배양 여과액을 100,000 x g 로 4°C에서 2시간 동안 원심분리합니다.
4. 부드러운 피펫팅을 통해 총 1mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 막질 펠릿을 재현탁합니다.
5. 2.4단계에서 얻은 펠릿 현탁액 0.5mL를 60% 요오딕산올 용액 1.5mL와 혼합하여 최종 요오딕산올 농도 45% wt/vol을 산출합니다. 이 혼합물을 13mm x 51mm 폴리프로필렌 얇은 벽 초원심분리기 튜브의 바닥에 분배합니다.
6. MEV-요오딕사놀 45% 현탁액을 40%, 35%, 30%, 25% 및 20%(PBS의 vol/vol) 요오딕산올 용액 1mL와 PBS 1mL를 맨 위에 겹쳐 놓습니다.
7. 4°C에서 18시간 동안 100,000 x g 에서 원심분리합니다.
8. 1mL Hamilton 주사기를 사용하여 위에서 시작하여 1mL 밀도 구배 분획을 수집합니다.
9. 수집된 각 분획을 PBS로 20mL로 희석하고 4°C에서 2시간 동안 100,000 x g 으로 원심분리합니다.
10. 상청액을 제거하고 펠릿을 0.5mL의 PBS에 현탁합니다. 이 펠릿은 4°C에서 보관하십시오.

재료