박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

초록

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)

이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 박테리아 균주 및 배양 조건

메모: 이 연구에 사용된 박테리아 균주는 대장균 MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve 및 Bifidobacterium dentium이었습니다.

1. 대장균의 경우, 멸균 루프를 사용하여 단일 콜로니를 250 내지 1,000mL의 Luria-Bertani(LB) 국물에 접종하고 배양을 처리하기 전에 300rpm 및 37°C의 진탕 인큐베이터에서 48시간 동안 호기적으로 배양합니다. p114-mCherryClyluc가 함유된 재조합 대장 균 MP1 균주의 경우, 클로람페니콜을 LB 한천에 첨가하고 최종 농도 17μg/mL의 국물로 첨가합니다.

2. A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve 및 B. dentium의 경우 BHI(Brain Heart Infusion) 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 비닐 혐기성 챔버 내에서 혐기성 배양합....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 mL 플랫 캡, 얇은 벽 PCR 튜브	써모 사이언티픽	3430	Qubit으로 정확한 판독값을 얻으려면 벽이 얇은 PCR 튜브를 사용하는 것이 중요합니다
16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액	전자현미경 과학	15700
250 mL Fiberlite 폴리프로필렌 원심분리기 병	써모피셔	010-1495
500 mL Fiberlite 폴리프로필렌 원심분리기 병	써모피셔	010-1493
65mm 폴리프로필렌 원형/원추형 병 어댑터	베크만 쿨터	392077	Vivacell이 로터에 맞도록 허용
아커만시아 뮤시노필라	ATCC	BAA-835 시리즈
Amicon-15(100kDa MWCO)	밀리포어시그마	UFC910024
Avanti J-20 XPI 원심분리기	베크만 쿨터		Beckman에서 더 이상 판매하지 않습니다. Avanti J-26XP는 가장 가까운 현대 모델입니다.
박테로이데스 테타이오타오미크론 VPI 5482	ATCC	29148
비피도박테리움 브레베	NCIMB	B8807
비피도박테리움 덴티움	ATCC	27678
뇌심장 주입(BHI) 국물	히미디어	M2101	고압멸균 후, BHI 국물과 한천을 모두 혐기성 챔버에 도입하고 메나디온(1μg/L), 헤마틴(1.2μg/L) 및 L-시스테인 염산염(0.05%)을 보충했습니다. 그런 다음 혐기성 박테리아 균주를 접종하기 전에 혐기성 조건에서 최소 24시간 동안 배양했습니다.
C-300 미세유체 카트리지	스펙트라인
클로람페니콜	MP 바이오메디컬	ICN19032105
대장균 HST08 (스텔러 컴펜트 셀)	타카라	636763
대장균 MP1 파일	마크 굴리안 박사(선물)		쥐 장에서 유래한 공생 박테리아
Fiberlite 500 mL - 250 mL 어댑터	써모피셔	010-0151-05	Fiberlite 로터와 함께 사용하여 250mL 병을 더 작은 크기의 시작 박테리아 배양에 사용할 수 있습니다.
Fiberlite 고정각 원심분리기 로터	써모피셔	F12-6x500-렉스	6 x 500 mL 병에 적합
Lauria Bertani (LB) 국물, 밀러	디프코	244620