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1. 박테리아 균주 및 배양 조건
메모: 이 연구에 사용된 박테리아 균주는 대장균 MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve 및 Bifidobacterium dentium이었습니다.
1. 대장균의 경우, 멸균 루프를 사용하여 단일 콜로니를 250 내지 1,000mL의 Luria-Bertani(LB) 국물에 접종하고 배양을 처리하기 전에 300rpm 및 37°C의 진탕 인큐베이터에서 48시간 동안 호기적으로 배양합니다. p114-mCherryClyluc가 함유된 재조합 대장 균 MP1 균주의 경우, 클로람페니콜을 LB 한천에 첨가하고 최종 농도 17μg/mL의 국물로 첨가합니다.
2. A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve 및 B. dentium의 경우 BHI(Brain Heart Infusion) 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 비닐 혐기성 챔버 내에서 혐기성 배양합니다. 단일 콜로니를 사전 환원된 BHI 국물 100mL에 접종하고 혐기성 48시간 동안 배양합니다.
2. EV 격리
1. 원심분리 및 여과에 의한 박테리아 배양 배지 정화
1. 1단계에서 접종한 박테리아 세포 배양액을 옮겨 250mL 또는 500mL 폴리프로필렌 원심분리기 병을 세척합니다. 대용량 고정 각도 로터에서 병을 4°C 및 5,000 × g에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 부어 깨끗한 원심분리기 병에 옮기고 10,000 × g에서 15분 동안 다시 원심분리합니다.
메모: 생물 안전에 적합한 세척 및 오염 제거 후 병을 재사용하십시오.
1. 두 번째 원심분리 후 큰 박테리아 세포 펠릿이 존재하는 경우 깨끗한 병에서 원심분리를 반복하여 세포를 추가로 제거합니다.
2. 상청액을 적절한 크기의 0.22μm 폴리에테르설폰 진공 구동 필터 장치에 부어 옮깁니다. 여과 장치를 진공 벽 공급 장치에 연결하여 여과합니다. 여과율이 크게 떨어지면 여과되지 않은 물질을 새 장치로 옮기기만 하면 됩니다. 여과된 배지를 4°C에서 밤새 보관하고 원하는 경우 다음날 프로토콜을 계속합니다.
메모: 위의 원심분리는 일반적으로 각 장치를 통해 표시된 세포 배양 부피의 ~2배를 처리할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 500mL 필터 장치로 ~1,000mL의 사전 원심분리 배양물을 여과할 수 있습니다. 이러한 장치는 일반적으로 재사용되지 않습니다. 이 단계에서 주사기 필터를 사용하는 것은 테스트 모델에서 상당한 손실이 발견되었으므로 최적화 없이 권장되지 않습니다. 이것은 잠재적인 중지 지점입니다.
3. 여과된 상청액의 분취량을 적절한 한천 플레이트에 퍼뜨려 이 시점에서 생존 세포가 완전히 제거되었는지 확인하고 박테리아 균주에 대한 최적의 조건에서 배양한 후 콜로니가 없는지 확인합니다. 박테리아가 검출되면 추가 원심분리 및/또는 여과를 수행하여 위의 절차를 더욱 최적화하십시오.
2. 여과된 매체의 농도
1. 100mL> 상당한 용량으로 작업하는 경우 2.2.2단계로 진행합니다. ~100mL의 부피로 작업하는 경우, 혈청학적 피펫을 사용하여 각 용량 100kDa 분자량 차단(MWCO) 원심 한외여과 장치의 저장소에 여과된 배양 배지 90mL를 로드합니다. 항상 일치하는 한외여과 장치로 균형을 맞추고 상단 저장소의 배지 부피가 <0.5mL로 농축될 때까지 4°C 및 2,000×g에서 15-30분 간격으로 스윙 버킷 로터에서 원심분리합니다.
1. 남은 여과된 배양 배지로 저장소를 채웁니다. "충전"하는 경우 장치 하단의 흐름을 제거하고 모든 장치의 균형을 재조정합니다.
메모: 이러한 장치를 사용하여 농축할 수 있는 여과된 배양 배지의 최대 부피는 권장 부피의 <2배인 것으로 관찰되었습니다.
2. 저장소의 농축 배지의 점도가 눈에 띄게 증가하면(어둡고 점성이 있는 물질), 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석하고 원심분리에 의해 재농축하여 100kDa의 MWCO보다 작은 비-EV 단백질을 희석합니다.
메모: 이것은 잠재적인 중지 지점입니다.
3. 농축된 배지를 저단백질 결합 튜브로 옮기고 밤새 4°C에서 보관하고 원하는 경우 다음날 프로토콜을 계속합니다.
2. 부피가 상당히 >100mL로 작업하는 경우 처리할 부피를 수용할 수 있는 적절한 크기의 접선 흐름 여과(TFF) 장치(100kDa MWCO)를 선택합니다.
메모: 100mL에서 >1,000mL를 처리하기 위한 여과 장치가 시중에서 판매되고 있습니다. 현지 가용성, 비용, 펌프 및 튜브/연결부와의 호환성에 따라 어떤 특정 모델이 가장 유용한지 결정됩니다. 필터를 세척하기 전에 최대 2L의 배양 배지를 재료표에 표시된 장치로 처리했습니다(세척 프로토콜은 아래 2.3단계 참조).
1. #16 저결합/저침출 튜브, 1/8인치 호스 미늘-루어 어댑터, TFF 장치 및 연동 펌프로 여과 회로를 조립합니다.
메모: 환경 박테리아로 EV 준비물을 오염시킬 위험을 최소화하기 위해 생물 안전 캐비닛 내에서 TFF를 수행합니다.
2. 실온에서 여과되고 컨디셔닝된 배지를 약 200mL/min(최소 100mL/min)으로 순환하기 시작합니다. 200mL의 PBS를 눈금이 매겨진 용기에 펌핑하여 원하는 유량에 해당하는 적절한 RPM을 결정합니다. 여과되고 조절된 배지를 순환시킬 때 한외여과막을 가로지르는 분자<100kDa를 별도의 용기에 폐기물로 수집합니다.
메모: 아래 예는 배양액 2L의 시작 부피를 가정합니다.
3. 부피가 ~ 100-200mL로 감소할 때까지 컨디셔닝된 배지를 계속 순환시킵니다. 필요에 따라 더 작은 용기로 이동합니다. PBS로 2배 희석하고 펌프와 함께 계속 순환하여 75-100mL까지 농축합니다. PBS로 2배 희석하고 최종 부피 25mL까지 계속 순환시킵니다. PBS로 2배 희석하고 <10mL까지 계속 순환시킵니다.
4. 샘플 저장소에서 공급 튜브를 들어 올리고 계속 펌핑하여 필터를 퍼지하고 최대 양의 샘플을 회수합니다.
메모: 이것은 잠재적인 중지 지점입니다.
5. 농축된 샘플을 원추형 튜브로 옮기고 원하는 경우 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 또는 프로토콜을 계속합니다.
6. 농축된 샘플을 15mL 용량의 100kDa MWCO 원심 한외여과 장치로 옮깁니다. 상단 저장소의 배지 부피가 <2mL로 농축될 때까지 4°C 및 2,000 × g에서 15-30분 간격으로 스윙 버킷 로터에서 원심분리합니다.
메모: 이것은 잠재적인 중지 지점입니다.
7. 농축된 배지를 저단백질 결합 튜브로 옮기고 밤새 4°C에서 보관하고 원하는 경우 다음날 프로토콜을 계속합니다.