크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리

초록

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)

이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

프로토콜

1. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
메모: SEC는 세포외 소포(EV)의 순도를 높이고 비소포성 단백질을 제거하는 데 사용됩니다.

1. <100mL의 출발 물질에서 EV를 분리하려면 작은 SEC 컬럼(10mL 베드 부피)을 사용하고 >100mL의 출발 물질에서 EV를 분리하려면 더 큰 컬럼(47mL 베드 부피)을 사용합니다.
   메모: 아래 예에서는 괄호 안에 더 큰 열의 볼륨과 더 작은 열의 볼륨을 나열합니다.
2. SEC 컬럼과 인산염 완충 식염수(PBS)를 몇 시간에 걸쳐 실온에 둡니다. 표준 실험실 스탠드와 홀더를 사용하여 SEC 컬럼을 수직 위치에서 안정화합니다. 또는 상업용 크로마토그래피 컬럼 스탠드를 사용하십시오.
3. SEC 컬럼에 연결하기 전에 5mL의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 시료 저장소를 수화시킵니다. SEC 컬럼의 입구 캡을 풀고 샘플 저장소에 PBS 2mL를 추가한 다음 PBS가 프릿을 통해 떨어질 때 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다(소형 SEC 컬럼에는 적용되지 않음). 메모: 이 이전 단계는 기포가 SEC 컬럼 상단에 갇히는 것을 방지합니다. 공기가 갇힌 경우 저장소를 제거하고 기둥을 두드려 기포를 빼낸 다음 연결 절차를 반복합니다. 더 작은 컬럼의 경우 SEC 컬럼 상단의 캡을 풀고 샘플 호퍼를 부착하기만 하면 됩니다.
4. 47mL(10mL)의 PBS를 시료 저장소에 넣고 SEC 컬럼 바닥의 캡을 풉니다. 평형화를 위해 로드된 모든 샘플 버퍼가 컬럼을 통해 흐르도록 합니다. 플로우스루를 버립니다.
5. 최대 2mL(0.5mL)의 샘플을 샘플 저장소에 로드하고 플로우 스루를 버리고 샘플이 컬럼에 완전히 들어갈 수 있도록 합니다.
6. PBS를 시료 저장소 또는 호퍼에 14.25mL에서 시료 부피를 뺀 용량(소형 컬럼의 경우 3mL에서 시료 부피을 뺀 값)으로 즉시 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 하고 컬럼 보이드 부피와 동일한 양을 버립니다.
   메모: 일반적인 2mL 샘플의 경우 샘플 저장소 또는 호퍼에 첨가할 PBS의 양은 12.25mL입니다.
7. 2mL 저결합 마이크로튜브를 SEC 컬럼 바로 아래에 배치합니다. 즉시 2mL(0.5mL)의 PBS를 시료 저장소에 넣고 컬럼에 들어가도록 합니다. 플로우 스루의 처음 2mL(0.5mL)를 분 획 1로 라벨링합니다. 샘플 저장소에 한 번에 2mL(0.5mL)를 계속 추가하여 각 후속 분획을 수집합니다.
   메모: 대부분의 박테리아 EV는 처음 5개의 분획에서 용리됩니다. 최적화하는 동안 처음 12개의 분획이 수집되었습니다.
8. 분획물을 단기 보관(일)의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -80°C에서 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
qEV 원본, 35nm	이존		0.5mL의 최대 로딩 부피
qEV 랙	이존		qEV 오리지널 SEC 컬럼과 함께 사용
qEV-2, 35nm	이존		최대 로딩 부피 2mL
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR 클린 튜브	에펜도르프	30108450