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1. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
메모: SEC는 세포외 소포(EV)의 순도를 높이고 비소포성 단백질을 제거하는 데 사용됩니다.
- <100mL의 출발 물질에서 EV를 분리하려면 작은 SEC 컬럼(10mL 베드 부피)을 사용하고 >100mL의 출발 물질에서 EV를 분리하려면 더 큰 컬럼(47mL 베드 부피)을 사용합니다.
메모: 아래 예에서는 괄호 안에 더 큰 열의 볼륨과 더 작은 열의 볼륨을 나열합니다. - SEC 컬럼과 인산염 완충 식염수(PBS)를 몇 시간에 걸쳐 실온에 둡니다. 표준 실험실 스탠드와 홀더를 사용하여 SEC 컬럼을 수직 위치에서 안정화합니다. 또는 상업용 크로마토그래피 컬럼 스탠드를 사용하십시오.
- SEC 컬럼에 연결하기 전에 5mL의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 시료 저장소를 수화시킵니다. SEC 컬럼의 입구 캡을 풀고 샘플 저장소에 PBS 2mL를 추가한 다음 PBS가 프릿을 통해 떨어질 때 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다(소형 SEC 컬럼에는 적용되지 않음). 메모: 이 이전 단계는 기포가 SEC 컬럼 상단에 갇히는 것을 방지합니다. 공기가 갇힌 경우 저장소를 제거하고 기둥을 두드려 기포를 빼낸 다음 연결 절차를 반복합니다. 더 작은 컬럼의 경우 SEC 컬럼 상단의 캡을 풀고 샘플 호퍼를 부착하기만 하면 됩니다.
- 47mL(10mL)의 PBS를 시료 저장소에 넣고 SEC 컬럼 바닥의 캡을 풉니다. 평형화를 위해 로드된 모든 샘플 버퍼가 컬럼을 통해 흐르도록 합니다. 플로우스루를 버립니다.
- 최대 2mL(0.5mL)의 샘플을 샘플 저장소에 로드하고 플로우 스루를 버리고 샘플이 컬럼에 완전히 들어갈 수 있도록 합니다.
- PBS를 시료 저장소 또는 호퍼에 14.25mL에서 시료 부피를 뺀 용량(소형 컬럼의 경우 3mL에서 시료 부피을 뺀 값)으로 즉시 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 하고 컬럼 보이드 부피와 동일한 양을 버립니다.
메모: 일반적인 2mL 샘플의 경우 샘플 저장소 또는 호퍼에 첨가할 PBS의 양은 12.25mL입니다. - 2mL 저결합 마이크로튜브를 SEC 컬럼 바로 아래에 배치합니다. 즉시 2mL(0.5mL)의 PBS를 시료 저장소에 넣고 컬럼에 들어가도록 합니다. 플로우 스루의 처음 2mL(0.5mL)를 분 획 1로 라벨링합니다. 샘플 저장소에 한 번에 2mL(0.5mL)를 계속 추가하여 각 후속 분획을 수집합니다.
메모: 대부분의 박테리아 EV는 처음 5개의 분획에서 용리됩니다. 최적화하는 동안 처음 12개의 분획이 수집되었습니다. - 분획물을 단기 보관(일)의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -80°C에서 보관합니다.