면역학적 시냅스 형성을 통한 T 세포의 시험관 내 세균 이식

초록

출처: Cruz-Adalia, A., et al. T 세포는 수지상 세포에서 이식을 통해 박테리아를 포획합니다. J. Vis. 경험. (2016).

이 비디오는 항원 특이적 T 세포-수지상 세포 상호작용을 통한 박테리아 형질감염을 보여줍니다. 난아알부민 펩타이드를 나타내는 박테리아에 감염된 수지상 세포는 직접 또는 막으로 분리된 T 세포와 함께 배양됩니다. 직접 접촉은 면역학적 시냅스 형성을 가능하게 하여 박테리아 전달을 가능하게 하는 반면 막은 상호 작용을 방지합니다. 그런 다음 세포외 박테리아를 제거하기 위해 겐타마이신 처리가 수행됩니다.

프로토콜

참고: 생쥐는 특정 병원균이 없는(SPF) 사육에서 사육되었으며 이산화탄소(CO₂) 흡입 방법을 사용하여 훈련되고 자격을 갖춘 직원에 의해 안락사되었습니다.
1. 마우스 골수 유래 수지상 세포(DC) 분화 및 감염참고: 그림 1 은 이 첫 번째 단계를 요약한 것입니다. 이 시점부터 모든 절차는 멸균 배지, 기구, 피펫 팁 및 배양 접시만 사용하여 후드에서 수행해야 합니다.

1. 마우스 골수 유래 DC 분화
   1. C57/BL6 마우스 한 마리의 경골과 대퇴골을 해부하고 10ml의 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지와 함께 플라스틱 접시에 옮깁니다.
   2. 멸균 가위로 각 골단을 잘라내고 특징적인 밝은 빨간색을 띠는 골수를 노출시킵니다.
   3. 멸균 페트리 접시에 멸균 주사기를 사용하여 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(PBS/BSA/EDTA 완충액)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS) 10ml를 뼈 내부에 주입합니다.
   4. 세포 현탁액을 수집하고 냉장 원심분리기(4°C)에서 600 x g의 튜브에 원심분리합니다.
   5. 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액 1ml(0.15M 염화암모늄(NH₄Cl), 10mM 중탄산칼륨(KHCO₃) 및 0.1mM EDTA)에 세포를 재현탁하고 적혈구를 제거하기 위해 실온(RT)에서 30초 동안 배양합니다.
   6. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 함께 RPMI 1640 배지 10ml를 첨가하고 세포 여과기(70μm)를 통해 뼈 조각과 세포 덩어리를 제거한 후 동일한 속도(600xg)로 원심분리하여 여과에 의해 덩어리가 제거되었습니다.
   7. 세포를 계수하고 RPMI 10% FBS(50μM B-메르캅토에탄올, 1mM 피루브산나트륨 포함)로 5 x 10⁵ cells/ml로 조정하고 20ng/ml 재조합 쥐 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(rm-GM-CSF)를 최종 농도로 추가합니다.
   8. 이 현탁액을 멸균, 미생물학적 품질, 15cm 페트리 접시에 첨가하고 CO₂ 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 배양합니다.
   9. 3일마다 PBS에서 5mM EDTA로 비부착 세포와 분리된 세포를 모두 스핀다운하고 20ng/ml rm-GM-CSF를 포함하는 신선한 배지로 5 x 10⁵ 세포/ml의 세포 밀도로 재현탁합니다.
2. DC 및 항원 로딩의 성숙
   1. 9일째에 20 ng/ml rm-GM-CSF를 포함하는 배지에 5 x 10⁵ cells/ml의 밀도로 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 20ng/ml의 지질다당류(LPS)를 첨가하여 세포에서 높은 주요 조직적합성 복합체 또는 MHC-II 발현을 허용하고 조직 배양되지 않은 멸균 15cm 페트리 접시에서 24시간 동안 배양합니다.
   2. LPS 자극 1일 후, 마우스 CD11c, MHC-II 및 과립구 수용체-1 또는 Gr-1에 대한 항체로 일부 DC 세포를 염색하여 유세포 분석에 의한 DC 분화를 확인합니다. DC의 유세포 분석 분석의 예는 그림 3A 및 3B에 나와 있습니다.
      1. DC(5 x 10⁵ 세포/샘플)를 항-마우스-CD16/CD32 단클론 항체와 함께 샘플당 50 μl PBS/BSA/EDTA 완충액에서 최종 농도 2.5 μg/ml로 배양합니다. 그 후, PBS/BSA/EDTA 완충액에 각각 1:100, 1:200 및 1:500으로 서로 다른 형광색소와 접합된 MHC-II(I-A/I-E), CD11c 및 Gr-1에 대한 항체 50μl를 첨가합니다.
      2. 마지막으로 PBS/BSA/EDTA 완충액으로 DC를 세척하고 제조업체의 프로토콜에 따라 유세포 분석법으로 분석합니다.
         참고: 세포가 잘 분화되면 항원 로딩이 준비된 것입니다.
   3. RPMI 10% FBS(항생제 없음)로 DC를 세척하고 10μg/ml OTII 오보알부민 펩타이드(OVAp)(OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R)를 플라스틱 튜브에 5 x 10^{6 DC} 당 1ml의 RPMI 10% FBS 배지에 넣고 37ºC에서 최소 1시간 동안 투여합니다. 음성 대조군으로서, OVAp와 함께 배양하지 않고 DC를 그대로 두십시오.
3. DC 감염
   1. CO₂ 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 1시간 동안 10개의 박테리아(DC당 10개의 박테리아)의 감염 다중도(MOI)로 DC를 감염시킵니다.
   2. 대부분의 세포외 박테리아를 세척하기 위해 DC 세포를 PBS에서 3회, RMPI 10% FBS에서 1회 세척하고 450 x g에서 원심분리합니다. 마지막으로, RMPI 10% FBS 배지(항생제 없음)에 세포를 20 x 10⁶ cells/ml로 재현탁합니다.

2. OTII 형질전환 마우스에서 CD4⁺ T 림프구의 분리 참고: 그림 1은 이 두 번째 단계를 요약한 것입니다. 림프절의 CD4⁺ 림프구 비율(~50%)이 비장(~25%)보다 크기 때문에 정제가 더 효과적이기 때문에 CD4⁺ T 세포를 분리하기 위해 비장 대신 림프절을 사용해야 합니다.

1. 림프절의 단일 세포 현탁액 만들기
   1. OTII 형질전환 마우스로부터 사타구니, 겨드랑이, 상완, 경부 및 장간막 림프절을 제거하고 10ml의 RPMI 10% FBS 배지가 담긴 플라스틱 접시에 옮깁니다.
   2. 두 개의 반투명 현미경 슬라이드를 사용하여 멸균 후드 아래에서 림프절을 분쇄합니다. 한 현미경 슬라이드의 반투명 면에 림프절을 놓고 장기가 분쇄될 때까지 두 번째 슬라이드의 반투명 면으로 문지릅니다.
   3. PBS/BSA/EDTA 완충액에서 단일 세포 현탁액을 세척합니다.
   4. 세포 여과기(70μm)를 통해 세포를 여과하여 결합 조직을 제거하고 PBS/BSA/EDTA 완충액으로 세척합니다.
   5. 적혈구를 제거하기 위해 1ml의 ACK 용해 완충액에 세포를 재현탁하고 RT에서 1분 동안 배양합니다.
2. CD4⁺ T 세포의 분리
   1. 2.1.3단계와 같이 다시 세척하고 세포를 계수하여 PBS/BSA/EDTA 완충액에서 100 x 10⁶ 세포/ml로 재현탁합니다. CD8, IgM, B220, CD19, MHC 클래스 II(I-Ab), CD11b, CD11c 및 DX5에 대한 비오티닐화 항체를 얼음 위에서 30분 동안 1:250으로 첨가하여 나중에 CD4⁺ T 세포를 음성 선택합니다.
   2. PBS/BSA/EDTA 완충액에서 세포를 세척하고 세포(100 x 10⁶ cells/ml)를 스트렙타비딘 마이크로비드와 함께 제조업체 프로토콜에서 권장하는 농도로 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
   3. CD4⁺ T 세포를 분리하기 전에 PBS/BSA/EDTA 완충액으로 세포를 세척하고 세포 스트레이너(30μm)를 통해 여과합니다.
   4. 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 세포 분리기를 사용하여 음성 선택으로 CD4⁺ T 세포를 분리합니다.
   5. 세포 수를 계산하고 RPMI 10% FBS 배지(항생제 없음)로 4 x 10⁶ cells/ml로 조정합니다.
   6. 분리된 CD4⁺ T 세포(3 x 10⁵ 세포)를 얼음 위에 고정하고 보관하여 유세포 분석기로 순도를 확인합니다. CD4⁺ T 세포 정제의 예가 그림 3C에 나와 있습니다.

3. 겐타마이신 보호 분석에 의한 T 세포 이식 측정 참고: 그림 2 는 프로토콜의 세 번째 단계를 요약한 것입니다.

1. T 세포 이식

1. 분리된 CD4⁺ T 세포를 감염된 DC 세포(1:1)와 함께 30분 동안 배양하여 CO₂ 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 면역 시냅스 형성을 허용합니다.

2. 24웰 배양 플레이트에 0.5ml의 분리된 CD4⁺ T 세포(2 x 10⁶ 세포)와 0.1ml의 감염된 DC(2 x 10⁶ 세포)를 추가합니다. 음성 대조군으로서, 10개의 박테리아의 MOI에서 0.5ml의 CD4⁺ T 세포를 30분 동안 직접 감염시킵니다.

3. DC-T 물리적 접촉을 방해하는 폴리카보네이트 트랜스웰 장벽(기공 크기 3μm)을 사용하여 감염된 DC를 T 세포에서 분리하는 추가 대조군을 포함합니다. 트랜스웰 내부에 0.1ml의 DC와 0.5ml의 CD4⁺ T 세포를 웰의 하부 구획(24웰 플레이트)에 추가합니다.

4. 마지막으로, 모든 샘플에서 동일한 부피를 만들기 위해 각 웰에 0.6ml가 있을 때까지 RMPI 배지로 완성합니다.

5. 면역 시냅스 형성 30분 후, 겐타마이신 100μg/ml를 첨가하고 1시간 동안 배양한 후 CO₂ 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 세포를 수집합니다.

결과

그림 1. DC 생성 및 CD4⁺ T 세포 분리의 흐름도. 그림의 왼쪽에는 골수 세포에서 수지상 세포(DC)를 구별하는 과정이 자세히 설명되어 있습니다. 대퇴골과 경골을 해부한 후 뼈 내부에서 골수 세포를 추출합니다. 그 후 적혈구(RBC)를 용해하고 골수 세포를 재조합 쥐 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로 9일 동안 배양합니다. 잘 분화되면 DC를 지질다당류(LPS)와 함께 배양하여 MHCI...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI	피셔 사이언티픽	SH3025501
r-GMCSF	페프로텍	315-03
LPS	시그마	L2630-10mg
Na 피루브산	써모 사이언티픽	SH3023901
2-ME	깁코	31350-010
오티아 (323–339)	젠스크립트	---
셀 스트레이너 70uM	BD	352350
30uM 주사기 Filcons 멸균	BD	340598
AutoMac 클래식	밀테니 바이오텍	130-088-887
겐타마이신	노몬	624601.6
트랜스웰	코스타	3415
파운드	프로나디사	1231
한천	프로나디사	1800
파라포름알데히드 16%	전자현미경 과학	15710
트리톤 X-100
CD8 비오	BD 바이오사이언스	553029
IgM 비오	면역단계	복제 RMM-1
B220 비오	BD 바이오사이언스	553086
CD19 비오	BD 바이오사이언스	553784
MHC-II 비오(I-A/I-E)	BD 바이오사이언스	553622
CD11b 비오	면역단계	11BB-01mg
CD11c 비오	면역단계	11CB3-01mg
DX5 비오	BD 바이오사이언스	553856
Gr-1 비오	BD 바이오사이언스	553125
CD16/CD32	면역단계	M16PU-05MG
살모넬라 방지	ABD 세로텍	8209-4006
CD11cPE	BD 바이오사이언스	553802
CD4-APC	톤보바이오사이언스	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD 바이오사이언스	553129
MHC-II(I-A/I-E) 피팅	BD 바이오사이언스	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 항체, 고교차 흡착	인비트로젠	A-21245
CMAC(7-아미노-4-클로로메틸쿠마린)	생명 기술	C2110
BSA	시그마	A7030-100G
스트렙타비딘 마이크로비즈	밀테니 바이오텍	130-048-101
BD FACSCanto II	BD 바이오사이언스	---