일정한 배지 흐름 하에서 일차 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 부착 평가

초록

출처: Jagau, H. et al. 일정한 흐름의 원발성 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 일정한 배지 흐름 조건에서 내피 세포의 VWF(Von Willebrand Factor) 스트링에 대한 폐렴구균 부착의 실시간 시각화를 보여줍니다. VWF 방출을 자극하고, 문자열에 라벨을 붙이고, 박테리아 결합을 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. VWF(Von Willebrand Factor)의 유도 방출 및 다량체화된 VWF 스트링의 시각화

1. 최대 200MDa의 긴 스트링에 대한 VWF의 다합체화를 트리거하려면 10 dyn/cm² 의 전단 응력이 필요하기 때문에 흐름 설정을 유지하십시오. 주입 포트를 사용하여 관류 튜브에서 순환하는 보충 혼합물(ECGMS)-배지와 함께 136μL의 100mM 히스타민 스톡 용액을 내피 세포 성장 배지에 주입하여 내피 WPB에서 VWF의 방출을 유도합니다. 유동 매체에서 히스타민의 최종 농도는 1mM입니다. 주입 포트를 사용할 수 없는 경우 펌프 저장소의 매체에 피펫팅하여 히스타민을 대체로 추가할 수 있습니다.
2. 다량체화된 VWF 스트링의 면역형광 검출을 위해, 저장소의 균형 잡힌 배지 수준에 도달하면 흐름을 멈추고 200μL 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)의 VWF 특이적 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합 항체 20μg을 주입 포트를 사용하여 순환하는 13.6mL의 ECGMS 배지에 주입합니다. 사용 가능한 주입 포트가 없는 경우, 펌프 저장소의 배지에 피펫팅하여 항체를 대안적으로 추가할 수 있습니다. 그 결과 최종 항체 농도는 1.3μg/mL입니다.
3. 짧은 시간에 여러 시야를 현미경으로 스캔하려면 30% 전력의 크세논 형광 장치와 epifluorescence 카메라가 있는 현미경의 형광 장치를 사용하십시오. 명시야 모드로 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 층의 모양과 형태를 모니터링하여 VWF-문자열 시각화에 적합한 대표 세포를 선택합니다.
4. 녹색 형광 VWF 스트링을 시각화하려면 현미경 소프트웨어(LasX)의 형광 단위 메뉴에서 63x/1.40 오일 대물렌즈와 470nm 검출 필터를 선택합니다. 각각 형태학적으로 온전한 약 10개의 HUVEC를 포함하는 최소 50개의 대표 필드 뷰의 Z-스택 스냅샷을 생성합니다. 서로 다른 시점에서 녹색 형광 VWF 스트링을 정량화하려면 여러 시야를 스캔하십시오.

2. 실시간으로 흐름에서 VWF 스트링에 대한 박테리아 부착의 현미경적 평가

1. 면역형광 검출을 통해 HUVEC 세포 표면에서 생성된 VWF 문자열에 대한 폐렴구균 부착을 정량화합니다.
   1. 흐름을 유지하고 주입 포트를 사용하여 최대 부피 1mL의 1.35 x 10⁸ CFU/mL 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 폐렴구균을 ECGMS 배지에 주입합니다. 또는 박테리아를 펌프 저장소의 배지에 피펫팅합니다. 전단 응력을 10dyn/^cm2 에서 다시 시작하여 박테리아가 펌프 시스템 내에서 순환하도록 합니다.
   2. 현미경 확대를 위해 63x 오일 침지 대물렌즈를 선택하고 RFP 발현 폐렴구균 검출을 위해 현미경 소프트웨어의 형광 필터 설정을 RFP 채널(540nm 검출 필터)으로 조정합니다.
   3. VWF 스트링에 대한 박테리아 부착의 정량화를 위해 흐름을 중지하고 각각 형태학적으로 온전한 약 10개의 HUVEC를 포함하는 최소 30개의 대표 필드 뷰의 Z-스택 스냅샷을 생성하고 폐렴구균의 수를 계산합니다.
   4. 데이터를 평가하기 위해 ANOVA 1요인 통계 알고리즘을 사용한 다음 자세한 통계 비교를 위해 사후 양측 짝을 이루지 않은 표본 검정을 사용합니다. <0.05의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

재료