제브라피쉬 배아에서 생체 재료 관련 세균 감염의 형광 이미징

초록

출처: Zhang, X., et al. 생체 재료 관련 황색포도상구 균 감염의 생체 내 시각화 및 생체 내 분석을 위한 제브라피쉬 배아 모델. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 황색포도상구균을 주입한 제브라피쉬 배아의 형광 이미징을 보여주며, 감염 진행 및 박테리아 분포를 정량화하여 생체 내 숙주-병원체 상호 작용에 대한 생체 재료 마이크로스피어의 영향을 평가할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 제브라피쉬 배아에서 감염 진행 및 유발된 세포 침윤의 형광 현미경

1. 배아를 0.02%(w/v) 3-아미노벤조산(트리카인)이 함유된 100mm 페트리 접시에 넣어 마취시켜 마취합니다. 5분 후, 배아를 0.02%(w/v) 트리카인을 함유한 E3 배지로 오버레이된 아가로스 플레이트로 옮기고 주입을 위해 한 방향으로 정렬합니다. PBS(인산염 완충 식염수)-2%(wt) 메틸셀룰로오스 용액 500μL를 0.02%(w/v) 트리카인이 포함된 E3 배지가 들어 있는 페트리 접시에 피펫팅합니다. 배아를 메틸셀룰로오스 용액에 넣고 똑바로 수평으로 유지합니다.
   메모: 메틸셀룰로오스 용액은 점도로 인해 이미징을 위한 최상의 방향으로 배아를 일시적으로 고정시킬 수 있는 "접착제"로 사용됩니다.
2. 명시야, mCherry, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 UV(자외선) 필터가 장착된 실체 형광 현미경을 사용하여 동일한 최적화 설정(예: 강도, 이득 및 노출 시간)에서 개별 배아를 160배 배율로 이미지화합니다. 명시야 필터를 사용하여 주사로 인한 조직 손상에 초점이 맞도록 초점면을 설정합니다. Z-스택 깊이를 10μm, 스텝 크기를 5μm로 설정하면 3개의 연속 이미지를 기록할 수 있습니다.
3. 주사 후 5시간부터 주사 후 2일까지 1일 1회 개별 배아를 이미지화합니다. 추가 이미징 및 분석을 위해 죽은 배아(심장 박동이 없거나 배아가 부분적으로 분해됨)를 제외합니다. 48웰 플레이트의 E3 배지에서 배아를 개별적으로 유지합니다. 매일 배지를 새로 고치십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
직경 10μm의 폴리스티렌 마이크로스피어(청색 형광등)	라이프 테크놀로지/테모피셔	F8829
3-아미노벤조산(트리카인)	시그마-알드리치	E10521-50G
실체 형광 현미경 LM80	라이카	MDG3610450126
메틸 셀룰로오스 4000cp	시그마-알드리치	MO512-250G
페트리 접시	송골매	353003
페트리 접시	바이오메리외	NL-132
이미지J	해당 없음	해당 없음	링크: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
그래프패드 7.0	프리즘	해당 없음