제브라피쉬 배아를 이용한 임플란트 관련 세균 감염의 생체 내 분석

초록

출처: Zhang, X. et. al., 생체 재료 관련 황색포도상구균 감염의 생체 내 시각화 및 생체 내 분석을 위한 제브라피쉬 배아 모델. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 이식된 생체 재료와 관련된 감염을 연구하기 위한 제브라피쉬 배아 모델을 보여줍니다. 폴리스티렌 마이크로스피어를 황 색포도상구균에 주입하면 박테리아 생존이 향상되어 이식된 재료의 감염 촉진 역할이 확인됩니다.

프로토콜

1. 박테리아 전용 및 박테리아-마이크로스피어 현탁액의 제조

메모: mCherry 형광 단백질을 발현하는 황색포도상구균 RN4220 균주(S. aureus-mCherry)가 사용됩니다. S. aureus RN4220 균주는 독성 조절 유전자 agrA (보조 유전자 조절자 A)에서 돌연변이가 있으므로 제브라피쉬 배아 모델에서 상대적으로 낮은 독성을 가질 수 있습니다. 생체 재료 관련 감염(BAI)에 대한 다른 S. aureus 균주 또는 기타 박테리아 종을 사용할 수 있습니다.

1. 10μg/mL 클로람페니콜이 보충된 트립스성 대두 한천 배양 플레이트에서 S. aureus RN4220 박테리아의 4 내지 5 콜로니를 취하고, 10μg/mL 클로람페니콜이 보충된 트립스 콩 국물 10mL에서 진탕 하에 37°C에서 중간 로그 성장기까지 배양한다.
   1. 배양하는 동안 620nm(OD₆₂₀)에서 광학 밀도(OD) 측정을 위해 큐벳(너비 1cm)에서 900μL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 박테리아 현탁액 100μL를 희석합니다. OD₆₂₀ 이 0.4-0.8에 도달할 때까지 박테리아를 배양합니다.
      메모: 0.1의 OD₆₂₀ 은 일반적으로 3.0 x 10⁷ 콜로니 형성 단위(CFU)/mL S. aureus에 해당합니다. 중간 로그 성장 단계에 있는 박테리아 접종물의 OD₆₂₀ 은 0.4-0.8 사이입니다. 다른 박테리아 종과 균주의 경우 배양을 위해 다른 기간이 필요할 수 있습니다.
2. 박테리아를 3,500 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿화된 박테리아를 멸균 PBS 1mL에 재현탁합니다. 그 후, 박테리아를 멸균 PBS로 2회 세척하고, 마지막으로 박테리아를 PBS의 4%(w/v) 폴리비닐피롤리돈40(PVP40) 용액 1.1mL에 재현탁합니다.
3. 이 박테리아 현탁액을 소용돌이치고 OD₆₂₀ 측정을 위해 큐벳에서 900μL의 멸균 PBS에 현탁액 100μL를 희석합니다. PVP40 용액으로 박테리아 현탁액의 농도를 조정하십시오. 이것은 "박테리아 전용" 현탁액입니다.
4. 생체 재료는 박테리아 현탁액과 혼합하도록 자유롭게 선택할 수 있습니다. 본 연구에서는 상업용 폴리스티렌(PS) 마이크로스피어(청색 형광등, 10μm)를 사용한다. 박테리아-마이크로스피어 현탁액을 생성하려면 마이크로스피어를 실온에서 1,000 x g에서 1분 동안 원심분리하고 상청액을 버리고 마이크로스피어를 "박테리아 전용" 현탁액(PVP40 용액)에 재현탁합니다.
5. 마이크로스피어가 있는 경우와 없는 상태에서 거의 동일한 용량의 박테리아를 주입하기 위해 박테리아-마이크로스피어 현탁액의 농도는 "박테리아 전용" 현탁액(마이크로스피어 제외) 농도의 2/3가 되어야 합니다. 이것은 박테리아-마이크로스피어 현탁액을 0.5부피의 PVP40 용액으로 희석함으로써 달성됩니다. 소용돌이로 현탁액을 혼합합니다. 주목할 점은 이 비율(3분의 2)이 S. aureus에 대해 평가되었다는 것입니다. S. epidermidis에도 적합하지만 이 비율이 다른 박테리아 종 및 주입할 생체 재료의 다른 크기(10μm 이상) 또는 모양(마이크로스피어보다 )에도 적용되는지 확인하는 것이 좋습니다.
6. 아래와 같이 10배 연속 희석액의 정량 배양에 의해 "박테리아 전용" 및 박테리아-마이크로스피어 현탁액의 농도를 확인하십시오: 현탁액 100μL를 96웰 플레이트로 옮기고 현탁액의 10μL 분취량을 멸균 PBS 90μL로 옮겨 연속적으로 희석합니다. 아가로스 플레이트에 희석되지 않은 현탁액과 희석된 현탁액의 10μL 분취량을 플레이트에 복제하고, 플레이트를 37°C에서 밤새 배양하고, 콜로니를 계산하고, 박테리아의 수(콜로니 형성 단위, CFU)를 계산합니다.

2. 제브라피쉬 배아의 번식, 수확 및 유지 관리

1. 제브라피쉬 배아의 번식, 수확 및 유지에 대한 일반적인 절차를 따르고 아래에 설명된 수정 사항을 따르십시오. 야생형 Tupfel 긴 지느러미(TL) 제브라피쉬 또는 선택된 형질전환 계통의 제브라피쉬(여기서는 Mpeg1: Kaede)의 가족을 그물이 추가된 탱크에서 교배하여 조명이 켜진 후 성체 암컷이 알을 생산하도록 유도한 다음 생산된 알에서 성체를 분리합니다.
2. 다음날 배아를 채취하고 생존 불가능한 불투명한 배아를 버립니다. 페트리 접시당 약 60개의 배아(직경 100mm)를 E3 배지에 보관하고 28°C에서 배양합니다. 죽은 배아와 비정상적인 배아를 제거하고 매일 E3 배지를 새로 고칩니다.

3. 주사 바늘의 준비

1. 마이크로피펫 풀러 기기를 사용하여 주입할 유리 미세모세관 바늘을 준비합니다. 다음 설정을 사용합니다: 열: 772, 당기기: 100, 벨: 200, 시간: 40, 가스: 75.
2. 바늘의 외경이 약 20μm(10μm 마이크로스피어의 경우)인 위치에서 안구에 스케일 바가 있는 광학 현미경을 사용하여 집게로 바늘 끝을 부수십시오. 개구부 크기가 매우 큰 바늘은 배아의 생존을 손상시킬 수 있으므로 피하십시오.
   메모: 개구부는 주입할 생체 재료의 크기와 모양에 따라 더 작거나 더 크게 선택할 수 있습니다. 문헌에서 약 50μm의 개구부가 있는 바늘을 사용한 주사는 배아 생존율을 현저하게 감소시키는 것으로 보고되었습니다.

4. 제브라피쉬 배아에 박테리아 전용 또는 박테리아 마이크로스피어 현탁액 주입

1. 전자레인지를 사용하여 아가로스 용액(데미워터에 1-1.5%(wt))을 가열하고 100mm 페트리 접시에 붓습니다. 페트리 접시의 아가로스 용액 위에 플라스틱 몰드 템플릿을 놓아 배아를 적절한 위치에 배치하고 주입을 용이하게 하기 위해 아가로스에 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 실온에서 배양하고 아가로스 용액이 응고되면 금형을 제거합니다.
2. 수정 후 3일, 배아를 0.02%(w/v) 3-아미노벤조산(트리카인)이 함유된 100mm 페트리 접시에 넣어 마취시킵니다. 5분 후, 배아를 0.02%(w/v) 트리카인을 함유한 E3 배지로 오버레이된 아가로스 플레이트로 옮기고 주입을 위해 한 방향으로 정렬합니다. Mpeg1의 경우: Kaede 형질전환 라인은 먼저 0.02%(w/v) 트리카인을 함유한 E3 배지에서 배아를 마취합니다. 그런 다음 실체 형광 현미경을 사용하여 녹색 형광 단백질을 발현하는 배아를 선택합니다.
3. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 약 10μL의 "박테리아 전용" 또는 박테리아-마이크로스피어 현탁액을 바늘에 로드합니다. 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 매니퓰레이터에 바늘을 장착합니다. 여기에 사용된 인젝터의 경우( 재료 표 참조) 2-3nL의 주입에 대해 압력: 300-350, 배압: 0, 시간: 2ms의 주입에 다음 설정을 사용합니다. 알림: 마이크로 인젝터의 설정은 사용된 인젝터에 따라 다릅니다. 다른 모양이나 크기의 생체 재료와 혼합된 박테리아를 주입하려면 인젝터 설정을 조정해야 할 수 있습니다.
   1. "박테리아 전용" 현탁액과 박테리아-마이크로스피어 현탁액을 주입할 때 동일한 구멍이 있는 바늘을 사용하십시오. 바늘이 부러지거나 막힌 경우 추가 주사를 위해 항상 새 바늘로 교체하십시오.
4. 바늘과 배아 몸체 사이의 각도로 광학 현미경(그림 1)으로 배아의 근육 조직에 바늘을 삽입합니다(그림 60). 바늘을 앞뒤로 부드럽게 움직여 조직에서 바늘의 위치를 조정합니다. 마이크로 인젝터에 연결된 풋 페달을 사용하여 배아를 주입합니다.
5. 형광 박테리아를 주입한 후 실체 형광 현미경으로 성공적인 감염을 위해 배아에 점수를 매깁니다. 음성으로 점수가 매겨진 배아를 버립니다(눈에 보이는 형광 박테리아 없음 또는 눈에 보이는 형광 마이크로스피어 없음). 48웰 플레이트의 E3 배지에서 배아를 개별적으로 유지합니다. 매일 배지를 새로 고치십시오.

5. 배아 분쇄, 현미경 채점 및 박테리아의 정량적 배양

1. 주사 직후 시작하여 정량적 배양을 위해 배아가 무작위로 선택될 때까지 입체 형광 현미경을 사용하여 형광 박테리아의 존재에 대해 모든 배아를 현미경으로 점수화합니다.
2. 주사 직후 몇 개의 살아있는 감염 배아(본 연구에서는 5-6개)를 무작위로 선택하고 멸균 팁을 사용하여 별도의 2mL 마이크로튜브로 개별적으로 옮깁니다. 배지를 제거하고 배아를 멸균 PBS로 부드럽게 세척한 다음 멸균 PBS 100μL를 추가합니다.
3. 각 바이알에 2-3개의 멸균 지르코니아 비드(직경 2mm)를 추가하고 균질화기( 재료 표 참조)를 사용하여 배아를 3,500rpm에서 30초 동안 분쇄합니다. 1.3단계에서 설명한 대로 균질을 정량적으로 배양합니다.
   메모: 다른 균질화기에는 다른 설정이 필요할 수 있습니다.
4. 5.3단계에 따라 정량적 배양을 위해 주사 후 이후의 날에 여러 배아를 무작위로 선택합니다.

결과

그림 1: 제브라피쉬 배아의 꼬리 근육에 박테리아-마이크로스피어 현탁액을 동시 주입하는 개략적인 절차.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립산 대두 한천	BD 디프코	236950	AMC의 미디어 준비 장치
트립산 콩 국물	BD 디프코	211825
폴리비닐피롤리돈40	응용	A2259.0250
직경 10μm의 폴리스티렌 마이크로스피어(청색 형광등)	라이프 테크놀로지/테모피셔	F8829
유리 마이크로 캐피라리 (1mm O.D. x 0.78mm I.D.)	하버드 장치	30-0038
마이크로피펫 풀러 기기	서터 인스트루먼트 Inc	불타는 p-97
광학 현미경 LM 20	라이카	MDG33 10450123
3-아미노벤조산(트리카인)	시그마-알드리치	E10521-50G
아가로스 MP	로슈	11388991001
실체 형광 현미경 LM80	라이카	MDG3610450126
마이크로로더 피펫 팁	에펜도르프	5242956.003
마이크로매니퓰레이터 M3301(M10 스탠드 포함)	세계 정밀 기기	00-42-101-0000
FemtoJet 익스프레스 마이크로 인젝터	에펜도르프	5248ZO100329
마이크로트루브 2ml pp	사르슈테트	72.693.005
지르코니아 비즈	바이오 커넥트	11079124ZX
MagNA 라이저	로슈	41416401
클로람페니콜	시그마-알드리치	C0378
자이로토리 셰이커(박테리아 성장용)	뉴브런즈윅 사이언티픽	G10
제브라피쉬 인큐베이터	VWR	인큐라인
큐 벳	낙인	759015
원심 분리기	헤티히-젠트리푸겐	로탄타 460R
분광기	파마시아 생명공학	울트로스펙®2000
집게	시그마-알드리치	F6521-1개
48 웰 플레이트	Greiner 바이오 원	677180
96 웰 플레이트	Greiner 바이오 원	655161
페트리 접시	송골매	353003
페트리 접시	바이오메리외	NL-132