단일 세포 박테리아 접종물의 제조

초록

출처: Niu, L., et al., 생체 내 현미경을 통한 제브라피쉬 배아의 마이코박테리아 감염 중 대식세포 용해 세포 사멸의 시각화. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 감염 분석 및 다운스트림 응용 분야에서 일관되게 사용하기 위해 후기 로그 단계 배양에서 Mycobacterium marinum 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 마이코박테리움 마리눔 단세포 접종물 제제(그림 1)

1. -80°C에서 청록색 형광 마이코박테리움 마리눔 글리세롤 스톡을 해동하고 7H10 한천 플레이트에 10%(v/v) OADC(올레산, 알부민, 포도당, 카탈라아제), 0.25% 글리세롤 및 50μg/mL 하이그로마이신을 접종합니다. 플레이트를 32°C에서 약 10일 동안 배양합니다.
2. 양성 형광을 발현하는 콜로니를 선택하고 3mL의 7H9 배지에 10% OADC, 0.5% 글리세롤 및 50μg/mL 하이그로마이신을 접종합니다.
   1. 배양액이 로그 단계(OD₆₀₀ = 0.6-1.0)에 도달할 때까지 32°C 및 분당 100회전(rpm)에서 4-6일 동안 접종을 배양합니다.
   2. OD_{600이 ~1.0} 에 도달할 때까지 10% OADC, 0.5% 글리세롤, 0.05% Tween-80 및 50μg/mL를 함유한 신선한 7H9 배지 30mL에서 계대배양(1:100).
      메모: 이 시점에서 최고의 배양 품질을 위해 하위 배양 단계를 권장합니다. 우리의 경험에 따르면 클론을 대량의 배지에 직접 추가하면 박테리아 덩어리가 형성됩니다.
3. 아래에 설명된 대로 M. marinum 세포를 수집합니다.
   1. 3,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 M. marinum 을 펠릿으로 수집합니다. 상청액 300μL를 제외한 모든 것을 버리고 펠릿을 재현탁하는 데 사용합니다.
   2. 10% 글리세롤과 함께 3mL의 7H9 배지를 첨가하여 펠릿을 추가로 재현탁시킨 다음 총 2분 동안 15초 ON, 15초 OFF에서 100W의 수조에서 현탁액을 초음파 처리합니다.
      메모: 초음파 처리는 접종물에 대한 단일 세포 균질을 달성하는 데 사용되며, 이는 미세 주입 바늘이 막히는 것을 방지합니다.
4. 박테리아 현탁액을 10mL 주사기에 옮기고 5μm 필터에 통과시켜 덩어리를 제거합니다.
5. 분광 광도계를 사용하여 현탁액의 광학 밀도(OD)를 측정하고 10% 글리세롤을 함유한 7H9 매체로 OD₆₀₀ = 1.0으로 희석합니다. 현탁액을 10μL 분취량으로 나누고 나중에 사용할 수 있도록 -80°C 냉동고에 보관합니다.
6. 10%(v/v)의 OADC, 0.5%의 글리세롤 및 50μg/mL의 하이그로마이신을 포함하는 7H10 한천 플레이트에 박테리아 스톡을 연속적으로 희석하고 도금하여 접종물의 박테리아 농도(cfu/mL)를 확인합니다.

결과

그림 1: 단일 세포 박테리아 준비의 개략도. 단일 세포 Cerulean-fluorescent Mycobacterium marinum 스톡은 설명된 공정에 따라 생성되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트윈-80	시그마	P1379
10mL 주사기	솔라바이오	YA0552
10% OADC	BD	211886
5μm 필터	밀레 엑스	SLSV025LS
하이그로마이신 50 μl/ml	상곤바이오텍	A600230
7시간 10분	BD	262710
7시간 9분	BD	262310
환경실	페콘	온도 제어 37-2 디지털
Eppendorf 마이크로로더	에펜도르프	제5242956003호
글리세롤	상곤바이오텍	A100854
부 화기	킬레인	PH-140(에이)
마이코박테리움 마리눔			ATCC BAA-535
초음파 처리기	SCICNTZ	JY92-IIDN
분광 광도계(OD600)	에펜도르프 AG	22331 함부르크