쥐 폐내피 세포의 세균 감염 후 세포독성 아밀로이드 획득

초록

출처: Balczon, R., et al. 녹농균에 의한 폐내피 세포 감염 후 세포독성 아밀로이드를 검출하는 방법. J. Vis. Exp. (2018)

이 비디오는 녹농균 감염 후 폐 내피 세포에서 세포독성 상청액을 생성하는 절차를 보여줍니다. 박테리아 이펙터 단백질이 숙주 세포 구조를 교란하고 세포독성 아밀로이드 올리고머의 상청액 방출을 유도하는 방법을 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 세포독성 상청액의 생성:

쥐 폐 미세혈관 내피 세포(PMVEC)의 1차 배양은 사우스 앨라배마 대학의 폐 생물학 센터의 세포 배양 핵심 시설에서 얻었습니다.

1. 세포독성 상청액을 생성하기 위해 2 x 10⁶ 세포를 개별 150cm 접시에 도금하고 합류가 이루어질 때까지 3 - 4일 동안 성장시킵니다. 실험당 두 개의 플레이트를 사용합니다.
2. 상청액을 생성하려면 PMVEC의 두 개의 150cm 접시 중 하나를 인산염 완충 식염수로 세척하고 트립신화한 다음 세포 수를 계산합니다. PMVEC의 다른 접시를 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 씻은 다음 20:1의 감염 다중도(MOI)로 녹 농균 균주를 감염시킵니다. 이는 다음과 같이 달성됩니다.
   1. 녹농균의 경우, OD₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFU/mL. 이 희석액을 준비하려면 1mL 일회용 큐벳에 1mL HBSS를 추가합니다. 분광 광도계를 사용하여 측정할 때 OD₅₄₀이 0.25에 도달할 때까지 플레이트에서 충분한 박테리아를 긁어냅니다.....

결과

그림 1. P. aeruginosa 의 접종이 PMVEC 형태에 미치는 영향. P. aeruginosa의 PA103 균주 추가(A) 전과 첨가 후 4시간 후(B) PMVEC의 합류 단층. 감염된 세포의 세포 단층에서 틈이 명확하게 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 100 μm

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HBSS	깁코	14025-092
PBS	깁코	10010-023
0.22 미크론 주사기 필터	밀리포어	SLGP033RS
DMEM	깁코	11965-092
Countess 자동 세포 계수기	인비트로젠	C10277
Microcetrifugation 농축기 - 10,000MW 컷오프	밀리포어	UFC801008
균주 PA103 및 ΔPcrV			P. aeruginosa의 이러한 균주는 위스콘신 주 밀워키에 있는 위스콘신 대학교 의과대학의 Dara Frank 박사로부터 얻었습니다
한천	어부	지압1423-500
태아 소 혈청	하이클론	SH30898.03IH
펜스트롭	깁코	15070063