생물발광을 사용한 마우스의 박테리아 감염 역학 추적

초록

출처: Valentine, ME, et al. 녹농균 에서 프레임 내 유전자 결실 돌연변이체의 생성 및 간단한 감염 마우스 모델에서 독성 감쇠 테스트. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 생쥐에서 독성 및 약독화된 박테리아 균주의 생체 내 거동을 시각화하고 비교하기 위해 생물 발광을 사용하는 방법을 보여줍니다. 생물발광 박테리아 현탁액의 제조와 마우스에 대한 복강내 주사에 대해 설명합니다. 독성 균주는 전신 확산을 나타내는 반면, 약독화된 균주는 국소적으로 유지되며 희미해지는 신호로 표시된 대로 점차적으로 제거됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주사에 의한 박테리아 균주의 동물 접종
   1. 주사 당일 아침에 테스트 중인 박테리아 균주의 냉동 바이알을 제거하고 4°C에서 3-4시간 동안 해동합니다. 주입할 각 마우스에 대해 0.5mL를 해동합니다. 해동 후 바이알을 얼음 위에 보관하고 2시간 이내에 마우스를 주사합니다.
   2. 해동 후, 각 냉동 튜브를 새로운 2mL 튜브로 옮기고 4,500 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 1 mL의 1x PBS(인산염 완충 식염수)에 재현탁합니다.
   3. 4,500 x g 에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 1x PBS에 2.5 x 10⁹ CFU/mL(CFU: 콜로니 형성 단위)의 최종 농도로 재현탁합니다. 사용되는 1x PBS의 정확한 양은 균주마다 약간 다릅니다.
      1. 위에서 설명한 대로 CFU/mL, 유전자형 및 표현형을 검증하기 위해 각 균주의 최종 현탁액에서 3개의 샘플을 채취합니다.
   4. 각 균주에 대해 1.5mL의 PBS/세포 현탁액을 5마리당 하나의 2mL 튜브에 분취하여 튜브가 들어가는 횟수를 제한합니다. 또한 대조군 주사를 위해 1x PBS 튜브를 준비합니다.
   5. 마우스(본 실험의 경우 그룹당 수컷 10마리, 암컷 C57BL/6 10마리)와 주사에 필요한 재료(주사기, 바늘, 날카로운 용기, 마커, 펜, 종이 등)를 채취한다. 불임 동물 수술실로 이동합니다. 소독용 물티슈로 모든 표면을 닦으십시오.
      1. 실험자에 대한 고통과 부상 위험을 제거하기 위해, 한 번에 하나의 성별 및 실험 마우스 그룹만 수술실로 데려오십시오(예: 특정 균주에 감염되는 10마리의 수컷 마우스 그룹). 물렸을 때 장갑에 구멍이 뚫리는 것을 방지하기 위해 라텍스 장갑 두 켤레를 착용하십시오. 오염을 방지하기 위해 실험실 가운, 보안경, 안면 마스크를 착용하십시오.
   6. 대조군에 1x PBS 주사를 시작합니다. 이것은 주사만으로 부작용이 발생하는지 여부를 확인할 것입니다.
      1. 케이지에서 마우스를 제거합니다. 한 번에 하나의 마우스만 제거하십시오.
      2. 마우스의 무게를 측정하고 주사 후 체중 감소를 추적하기 위해 유성 마커로 꼬리를 표시합니다.
      3. 새 1mL 주사기와 27G 바늘을 열고(오염을 제거하기 위해 각 마우스에 새 주사기와 바늘 사용) 멸균 1x PBS 200μL를 주입합니다.
         1. 엄지와 검지를 사용하여 귀 뒤의 마우스를 잡습니다. 꼬집어 목덜미에 피부 주름을 만들어 잡습니다 - 주름이 더 촘촘해지면 목의 움직임이 줄어들고 주사 중에 물릴 위험이 줄어듭니다. 새끼손가락을 사용하여 꼬리를 손바닥에 고정하여 거의 움직이지 않고 마우스를 평평하게 잡습니다.
         2. 마우스를 뒤집어 정중선의 왼쪽 또는 오른쪽에 있는 복막강에 바늘을 30° 각도로 삽입합니다. 삽입한 바늘을 살짝 들어 올려 장기가 아닌 복강 내 영역에 삽입되었는지 확인합니다. PBS를 천천히 주입한 다음 바늘을 빼냅니다.
         3. 사용한 바늘을 지정된 생물학적 위험 날카로운 용기에 넣으십시오. 주사기나 바늘을 재사용하지 마십시오. 주사 부위의 볼루스가 일반적입니다.
      4. 주사 후 마우스를 별도의 케이지로 옮깁니다.
      5. 다음 마우스로 절차를 반복합니다. 한 케이지의 모든 쥐를 주사한 후 즉시 원래 케이지로 되돌립니다.
   7. 대조군을 주입한 후 동일한 절차에 따라 테스트할 균주의 현탁액 주입을 시작합니다.
      1. 세포 현탁액 200μL를 주입합니다. 2.5 x 10⁹ CFU/mL의 세포 현탁액으로 시작할 때, 각 마우스는 5 x 10⁸ CFU를 받습니다.
         메모: 이러한 농도는 각 균주의 치사량을 결정하기 위한 예비 동물 연구를 통해 최적화되었습니다. 다른 균주/종에 맞게 투여량을 조정해야 할 수도 있습니다.
   8. 모든 주사가 완료되면 고통을 완화하기 위해 마우스를 주거실로 돌려보냅니다. 소독 물티슈로 작업 공간을 청소하십시오.
   9. 72시간 동안 3시간마다, 10일 동안 12시간마다 죽은 쥐가 있는지 케이지를 확인하여 주사 후 동물의 사망률을 모니터링합니다. 질병으로 인한 체중 감소를 결정하기 위해 12시간마다 마우스의 체중을 기록합니다.

재료