표적 유전자 결실을 위한 녹농 균의 이중 교차 재조합체 생성

초록

출처: Valentine, ME, et al. 녹농균 에서 프레임 내 유전자 결실 돌연변이체의 생성 및 간단한 감염 마우스 모델에서 독성 감쇠 테스트. J. Vis. 경험. (2020).

이 비디오는 플라스미드 기반 유전자 결실 전략을 사용하여 녹농 균에서 이중 교차 재조합체의 생성을 보여줍니다. 이 과정에는 단일 교차를 통해 게놈에 통합된 비복제 플라스미드를 보유한 박테리아를 선택한 다음 자당 선택 하에서 두 번째 재조합 사건을 유도하여 플라스미드를 절제하는 과정이 포함됩니다. 성공적인 이중 교차 재조합은 항생제 내성의 상실과 자당 함유 배지에서 성장할 수 있는 능력으로 확인됩니다.

프로토콜

1. P. aeruginosa의 이중 교차 재조합체의 검출

1. 각 국물 배양에 대해, 10% 자당(글리세롤 없음)이 보충된 PIA(슈도모나스 분리 한천) 플레이트에 10μL의 배양액을 접종하고 분리된 콜로니에 줄무늬를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 다음날 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 성장 여부를 검사합니다. 자당 저항성 콜로니는 이중 교차 재조합체여야 합니다(즉, 플라스미드 삽입물의 다른 상동 영역과 P. aeruginosa 염색체 사이의 재조합 사건을 통해 염색체에서 플라스미드를 제거함).
   1. 멸균 이쑤시개로 최소 20개의 콜로니를 1) PIA, 2) 10% 자당(글리세롤 없음)이 보충된 PIA 및 3) 300μg/mL의 카르베니실린이 보충된 PIA의 예열된 플레이트에 패치합니다.
3. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
4. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장 여부를 검사합니다. 진정한 이중 교차 재조합체는 카르베니실린에 민감하고 자당에 내성이 있습니다(즉, 자당이 보충된 PIA 및 PIA에서 성장했지만 카르베니실린이 보충된 PIA에서는 성장하지 않은 콜로니).

재료