액체 배양에서 Streptomyces venezuelae 포자의 준비 및 분리

초록

출처: Schlimpert, S., et al. 미세유체 장치를 사용한 전체 S. venezuelae 수명주기의 형광 타임랩스 이미징. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 Streptomyces venezuelae에서 포자의 배양 및 분리를 보여줍니다. 박테리아가 스트레스에서 생존하는 데 도움이 되는 휴면 세포인 포자는 영양분 제한 중에 생성되고 원심분리를 통해 수집됩니다. 이 방법은 다운스트림 응용 분야를 위한 순수하고 냉장 저장된 포자 현탁액을 보장합니다.

프로토콜

1. 신선한 Streptomyces venezuelae 포자의 분리 및 사용한 배양 배지의 제조

1. 60μl R2 미량 원소 용액(TE)이 보충된 30ml의 맥아당-효모 추출물-맥아 추출물(MYM) 배지에 SV60 균주 [attBφBT1::p SS209(PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]의 포자 10μl를 접종합니다. 세포의 일관된 성장과 포자 형성을 위해 충분한 통기를 허용하기 위해 배플 플라스크 또는 스프링이 포함된 플라스크를 사용하십시오.
2. 30°C 및 250rpm에서 35-40시간 동안 세포를 배양합니다.
3. 액체 장착 위상차 현미경으로 세포를 검사합니다. 이 시점에서 균사체 조각과 포자가 보입니다.
4. 탁상용 원심분리기에서 1ml의 세포를 400 x g으로 1분 동안 원심분리하여 균사체와 더 큰 세포 조각을 펠릿화합니다.
5. 포자 현탁액을 포함하는 약 300μl 상청액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 남은 배양 배지를 보관하십시오.
6. 포자를 MYM-TE(최종 농도: 0.5-5 x 10⁷ spores/ml)에서 1:20으로 희석하고 필요할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
   참고: Streptomyces 에서 포자 형성을 유발하는 정확한 조건은 이해되지 않았지만 포자 형성 배양에서 알려지지 않은 세포외 신호를 포함하여 사용한 MYM-TE 배지를 사용하면 포자 형성이 자극됩니다.
7. 나머지 배양 배지 10ml를 여과-멸균하여 포자와 균사체 단편이 없는 사용한 MYM-TE를 얻습니다. 멸균 0.22μm 주사기 필터를 사용하고 사용한 MYM-TE를 멸균 15ml 튜브로 옮깁니다.
8. 유사한 성장 조건을 사용하여 추가 실험을 수행해야 하는 경우 준비된 사용한 MYM-TE를 4°C에서 며칠 동안 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
맥아당-효모 추출물-맥아 추출물(MYM)4 g맥아당 4g 효모 추출물 10 g50% 수돗물과 50% 역삼투압수를 사용하여 1 L H2O를 첨가하고 고압멸균 후 100ml당 200ml의 R2 미량 원소 용액을 보충합니다.			Streptomyces venezuelae SV60 배양에 사용되는 포자 형성 배지
R2 미량 원소 용액(TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl 3-6H2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2Oa utoclave 및 4°C에서 보관			MYM에 0.002 볼륨 추가
PBS(인산염 완충 식염수)	시그마	P4417-100탭	단기 보관을 위한 플레이트를 준비하기 위해 B04A 플레이트에서 사용하지 않는 레인의 입구 웰을 다시 채우는 데 사용됩니다.
0.22 μm 주사기 필터	사토리우스 스테딤	16532-케이	사용한 MYM-TE의 준비