Streptomyces venezuelae 수명주기의 형광 타임랩스 이미징

초록

출처: Schlimpert, S. et al. 미세유체 장치를 사용한 전체 S. 베네수엘라의 수명주기의 형광 타임랩스 이미징. J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 미세유체 장치를 사용하여 박테리아 Streptomyces venezuelae 의 전체 수명 주기에 대한 형광 타임랩스 이미징을 통해 발아, 균사 성장 및 포자 형성을 실시간으로 시각화합니다.

프로토콜

1. 현미경 및 타임랩스 프로토콜 설정

메모: 이 방법은 sCMOS 카메라, 메탈 할라이드 램프, 하드웨어 자동 초점, 96웰 플레이트용 스테이지 홀더 및 환경 챔버가 장착된 완전 전동식 자동 도광시야 현미경에서 구현되었습니다.

1. 실험 시작 후 자동 초점 문제를 방지하기 위해 환경 챔버를 미리 30°C로 예열하십시오. 필요한 시간은 사용되는 환경 챔버, 현미경 및 가열 시스템에 따라 다릅니다. 실험 전날 밤에 시스템을 가열하기 시작합니다.
2. 현미경과 현미경 자동화 및 제어 소프트웨어를 켭니다. 최적의 신호 수집 및 공간 분해능을 위해 100X, 1.46 NA 오일 DIC 대물렌즈와 같은 높은 개구수(NA) 오일 침지 대물렌즈를 사용하십시오. 적절한 필터와 이색 거울을 선택하여 미분 간섭 대비(DIC) 이미지와 황색 형광 및 적색 형광 단백질 융합 이미지를 획득합니다.
3. 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 놓고 미세유체 플레이트의 이미징 창 하단에 침지 유체를 추가하여 이미지 획득 중 세포 초점을 개선합니다. 밀봉된 미세유체 장치를 도립 현미경의 스테이지에 조심스럽게 장착합니다. 플레이트가 스테이지 홀더에 단단히 배치되고 실험 과정에서 움직이지 않는지 확인하십시오.
4. 방향을 위해 내장된 위치 마커를 사용하여 미세유체 배양 챔버의 이미징 창에 초점을 맞춥니다. 트랩 높이 0.7μm에 해당하는 트랩 크기 5로 첫 번째 플로우 챔버("A"로 표시됨)의 가장 왼쪽 부분에 초점을 맞춥니다.
5. 미세유체 소프트웨어에서 입구 웰 8에서 4psi 동안 15초 동안 셀을 로드합니다. 이미징 창을 가로질러 스테이지를 움직여 배양 챔버의 세포 밀도를 확인합니다. 포자가 포획되지 않은 경우, 세포 로딩 단계를 반복하거나 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 로딩 압력 및/또는 시간을 증가시킵니다(2,048 x 2,048 픽셀의 이미징 창당 1-10개의 포자). 배양실에 과부하가 걸리지 않도록 하십시오. 메모: 우리는 일반적으로 스트렙토미세스를 이미징하기 위해 트랩 크기 5를 사용하지만 트랩 크기 4와 3에서도 좋은 결과를 얻었습니다.
6. 제어 소프트웨어에서 유량 프로그램을 시작하고 이미지 획득을 시작하기 전에 현미경 단계에서 미세유체 플레이트가 1시간 동안 열 평형을 이루도록 합니다.
7. 현미경 제어 소프트웨어에서 시간이 지남에 따라 여러 스테이지 위치에서 여러 이미지를 촬영하도록 다차원 획득을 설정합니다.
   1. 자동 저장의 경우: 이미지 파일을 자동으로 저장할 디렉토리를 지정합니다.
   2. 조명 설정의 경우 각 특정 구성에 대한 최적의 조명 설정을 미리 결정합니다. 설명된 실험의 경우 DIC 150msec, YFP 250msec, RFP 100msec의 노출 시간을 사용합니다.
   3. 시계열의 경우: 원하는 시점에서 이미지를 순서대로 획득하도록 시계열을 설정합니다. S. venezuelae의 수명주기를 이미징하려면 24시간 동안 40분의 시간 간격을 선택합니다.
   4. 스테이지 위치 및 자동 초점의 경우: 스테이지를 이동하여 배양실을 스캔하고 관심 있는 각 이미징 위치에 대한 스테이지 위치를 저장합니다. 단일 단계 위치가 광표백 및 광독성을 최소화할 수 있도록 충분히 떨어져 있는지 확인하십시오. 일반적으로 최대 12개의 위치를 사용합니다. 느린 초점 드리프트를 수정하기 위해 각 시점에 대해 자동 초점 루틴을 실행합니다. 현미경 제어 소프트웨어에서 사용할 수 있는 경우 자동 초점 전략을 "하드웨어 자동 초점에 의한 로컬 표면 업데이트"로 설정합니다. 선택한 스테이지 위치의 Z 좌표가 확인되면 하드웨어 자동 초점을 활성화합니다.
8. 현미경 제어 소프트웨어에서 타임랩스 실험을 시작합니다.
9. 모든 스테이지 위치가 나중에 여전히 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 몇 시간에 걸쳐 진행되는 타임랩스 실험의 경우 자동 초점을 사용하는 경우에도 스테이지 드리프트가 관찰되는 경우가 있습니다. 스테이지 위치를 다시 조정해야 하는 경우 적절한 시점에서 실험을 중지하고 초점을 조정한 다음 정의된 이미징 시간 간격 내에 실험을 다시 시작합니다.
10. 24-30시간 후 또는 관심 영역의 균사가 포자로 분화하면 이미지 획득을 중지합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 흐름 프로그램을 중지하고 미세유체 장치를 분해합니다.
11. 단기 보관을 위해 사용한 미세유체 플레이트를 준비합니다. 웰 1에서 6까지 남아 있는 배지를 제거하고 폐기물 웰 7과 셀 로딩 웰 8을 비웁니다. 멸균 조건에서 레인 "A"의 사용한 웰과 사용하지 않은 레인("B"에서 "D")의 웰을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트에 다시 채웁니다. 플레이트가 건조되지 않도록 파라필름으로 밀봉하고 4°C에서 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박테리아 세포용 B04A CellAsic ONIX 플레이트	머크-밀리포어	B04A-03-5PK	미세유체 배양 플레이트
CellAsic ONIX 미세유체 관류 시스템 및 ONIX FG(버전 5.0.2)	머크-밀리포어	EV-262	최신 ONIX 버전(2015년 7월) 및 프로그램 사용 방법에 대한 지침은 여기에서 확인할 수 있습니다. http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 현미경	자이스	431007-9902-000	완전 자동화 및 전동식 도립 광시야 현미경
인큐베이터 XL 멀티 S1(온도 모듈 S1 및 가열 장치 XL S2 포함)	자이스	411857-9061-000	현미경을 둘러싼 환경 챔버
Plan-Apochromat 100x/1.46 오일 DIC 대물렌즈	자이스	420792-9800-000
오크라 플래시 4 V2	하마마츠 포토닉스 주식회사	C11440-22CU
조명기 HXP 120V	자이스	423013-9010-000
FL 필터 세트 46 HE YFP 시프트 프리	자이스	489046-9901-000	형광 필터 세트, 여기 500/25 nm, 방출 535/30 nm
FL 필터 세트 63 HE RFP 시트 프리	자이스	489063-0000-000	형광 필터 세트, 여기 572/25 nm, 방출 629/30 nm
멀티웰 플레이트용 마운팅 프레임 K-M	자이스	000000-1272-644	미세유체 플레이트용 스테이지 홀더
젠 프로 2012	자이스	410135-1002-120	현미경 제어 소프트웨어
ZEN 모듈 타임랩스	자이스	410136-1031-110	타임랩스 현미경 실험을 설정하는 소프트웨어 모듈
ZEN 모듈 타일/위치	자이스	410136-1025-110	특정 스테이지 위치를 저장하는 소프트웨어 모듈(xzy)
피지	오픈 소스 소프트웨어 패키지	http://fiji.sc/Fiji	타임랩스 동영상 생성
PBS(인산염 완충 식염수)	시그마	P4417-100탭	단기 보관을 위한 플레이트를 준비하기 위해 B04A 플레이트에서 사용하지 않는 레인의 입구 웰을 다시 채우는 데 사용됩니다.
SV60 시리즈	John Innes Center 균주 컬렉션		divIVA-mcherry 및 ftsZ-ypet을 발현하는 S. 베네수엘라 균주