항생제 스트레스 하에서 녹농균 의 떼 행동

초록

출처: Bru, J., et al., 박테리아 떼의 타임랩스 이미징 및 집단 스트레스 반응. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 한천 플레이트 설정 및 타임랩스 이미징을 사용하여 중앙 배양에서 항생제와 혼합된 동일한 배양물을 포함하는 위성 지점으로의 박테리아 성장을 관찰하여 녹 농 균의 떼 행동을 분석하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 녹농균의 성장 과 도금 조건

1. 400mL의_ddH2O에 10g의 LB-밀러 분말 혼합물을 첨가하여 400mL의 용원성 국물(LB)을 준비합니다. 2% LB-한천 페트리 접시를 위해 8g의 한천을 추가로 추가합니다. 멸균을 위해 오토클레이브.
2. 용융된 LB-한천 배지 20mL를 직경 10cm의 페트리 접시에 붓고 실온에서 밤새 응고시킵니다. 액체 배지는 실온에, 한천 플레이트는 4°C에 보관합니다.
3. 멸균 루프 또는 나무 막대기를 사용하여 -80°C에서 보관된 냉동 육수에서 LB-한천 페트리 접시에 P . aeruginosa 를 줄무늬로 만듭니다. 페트리 접시를 37°C에서 밤새 거꾸로 배양합니다. LB-한천 플레이트를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
4. 멸균 루프 또는 나무 막대기로 페트리 접시에서 단일 콜로니를 선택하고 2mL LB 배지에 접종한 다음 100rpm으로 설정된 롤러 드럼에서 37°C에서 밤새 포화될 때까지 배양합니다.
5. P20 피펫을 사용하여 1.4단계의 하룻밤 배양 5μL를 피펫팅하고 스팟팅 영역에서 2.5cm 위 각도(10-45°)로 피펫 팁에 접근하여 스팟 플레이트의 중앙에 스팟을 피펫팅하고 첫 번째 정지까지 피펫팅하고 액체 방울만으로 한천을 만집니다(그림 1B).
   1. 한천을 손상시킬 수 있으므로 피펫 팁으로 한천을 만지지 마십시오. 템플릿을 사용하여 다양한 군집 한천 플레이트에 스팟을 일관되게 배치합니다.
6. 항생제 치료의 경우, 1.4단계의 하룻밤 배양 P. aeruginosa 를 3mg/mL 겐타마이신 6μL, 100mg/mL 카나마이신 10μL 또는 100mg/mL 포스포마이신 7.5μL와 혼합합니다. 즉시 다음 단계로 진행합니다.
   1. P20 피펫을 사용하여 항생제 처리된 녹농균 6 μL를 피펫팅하고 접시 중심을 중심으로 반경 2.8cm 동심원 상의 6개의 등거리 위성 위치에 스팟을 점포 영역 위 2.5 cm 각도(10 내지 45°)로 접근하여 첫 번째 정지까지 피펫팅하고, 액체 방울만으로 한천을 만집니다(그림 1D).
   2. 피펫 팁으로 한천을 만지면 손상될 수 있으므로 피하십시오. 일관성을 위해 도금 템플릿을 사용하십시오.
7. 투명한 페트리 접시 뚜껑을 검은색 뚜껑으로 교체합니다(그림 2A).
8. 75% 습도를 유지하기 위해 10L 수조와 함께 37°C로 설정된 인큐베이터의 스캐너에 떼를 지어 한천 플레이트를 놓습니다(그림 1E, 그림 2B). 주의: 떼를 지어 다니는 한천 플레이트의 얼룩덜룩한 세포를 방해하지 마십시오. 접시가 항상 위를 향하도록 하십시오.

결과

그림 1: P. aeruginosa의 군 집 분석 및 집단 스트레스 반응의 개략도. (A) P. aeruginosa는 37°C의 LB 국물에서 밤새 성장하고(약 1.5의 OD₆₀₀까지 16-18시간) 성장하고, (B) 군집 한천 플레이트의 중앙에 반점이 있습니다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
박토 한천, 탈수	BD 디프코	214010	LB-한천 플레이트 및 군집 한천 플레이트용
카사미노산	BD 디프코	223050	떼 매체용
D-포도당	피셔 케미칼	D16500	포도당. 떼 매체용
포스포마이신 이나트륨염	도쿄화학공업	F0889	원고 농도: 200mg/mL. ddH₂O에 용해
겐타마이신 설페이트	시그마-알드리치	지1914	스톡 농도: 3mg/mL. ddH₂O에 용해
카나마이신 설페이트	시그마-알드리치	60615	스톡 농도: 100mg/mL. ddH₂O에 용해
LB-밀러	BD 디프코	244620	LB 국물 및 LB-한천 플레이트용
황산마그네슘 칠수화물	시그마-알드리치	230391	떼 매체용
변종
녹농균	시랴폰 연구실	AFS27E.118	PA14 균주
공급
산화알루미늄 사포	3분	150 벌금	검은색 뚜껑용
블랙 패브릭	조앤	PRD7089	블랙 패브릭
블랙 스프레이 페인트	크릴론	5592 매트 블랙	검은색 뚜껑용
삼각 플라스크	키맥스	26500	250 밀리리터
유리 보관병	파이렉스	13951엘라	250 mL, 500 mL, 1000 mL
8인치 지퍼 타이	가드너 벤더	E173770	블랙 매트 원단 부착용
페트리 접시 (100mm x 15mm)	어부	FB0875712	100 x 15mm 폴리스티렌 플레이트
나무 막대기	어부	23-400-102	스트리킹 및 박테리아 접종용
설비
오토 클레이 브	마켓 포지 산업	STM-E	시약 멸균용
25mL 피펫	미국 사이언티픽, Inc.	1072-5410	한천 플레이트 떼를 짓기 위해 20mL를 피펫팅하려면
제 습기	프리지데어	FAD704DWD 70파인트	약 45%의 실내 상대 습도를 유지하기 위해
부 화기	VWR	89032-092	37°C에서 박테리아 증식용
등온 수조	어부	15-462-21분기	55 °C까지의 냉각 매체용
층류 후드	베이커 컴퍼니	SG603A	건조판용
P-20 피펫	길슨	F123601	떼를 지어 다니는 한천 판에 발견
피펫 컨트롤러	브랜드테크	아큐젯	한천 플레이트 떼를 짓기 위해 20mL를 피펫팅하려면