녹농균의 항생제 스트레스에 대한 군집 회피 반응 이미징 및 정량화

초록

출처: Bru, J., et.al. 박테리아 떼의 타임랩스 이미징과 집단 스트레스 반응. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 군집 한천 플레이트 분석을 사용하여 녹농 균의 군집 회피 행동을 시각화하고 측정하는 방법을 보여줍니다. 통제된 조건에서 타임랩스 이미징을 위한 설정을 보여주고 항생제 유발 스트레스 신호가 이미지 분석을 통해 정량화되는 박테리아 움직임의 방향을 바꾸는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 스캐너를 이용한 이미지 획득

1. 평판 문서 스캐너 위 40-60cm 랙에 검은색 무광택 천을 부착하여 페트리 접시의 주변 조명을 줄입니다. 지퍼 타이를 사용하여 고정합니다(그림 1B).
2. 스캐너는 스캐닝 소프트웨어와 자동 스크립팅 소프트웨어를 사용하여 제어됩니다.
   1. 스캔 소프트웨어에서 홈 모드를 선택합니다(그림 2A). 이미지 유형에서 색상을 선택하여 이미지를 컬러로 캡처합니다. 이미지 품질을 설정하려면 대상(Destination)에서 기타(Other)를 선택하고 해상도(Resolution)를 300dpi로 조정합니다. 대상 크기에 대해 원본을 선택하여 이미지의 표준 크기를 유지합니다. 표준 이미지 품질에 대해 이미지 조정 아래의 모든 옵션을 선택하지 않은 상태로 둡니다. 메모: 타겟 크기(Target Size) 는 기본적으로 원본(Original) 으로 설정되어 있습니다. 대상 크기에 대한 다른 옵션을 선택하려면 먼저 미리보기를 클릭합니다.
3. 스캔 오른쪽에 있는 폴더 아이콘을 클릭하여 이미지 저장 경로를 설정하여 파일 저장 설정을 엽니다(그림 2A).
   1. 위치(Location)에서 기타(Other)를 선택하여 이미지를 저장할 폴더 대상을 선택하고 찾아보기(Browse)를 클릭합니다. 이미지를 저장할 폴더를 선택합니다.
   2. 접두사 텍스트 상자에서 이미지 이름을 지정합니다. 시작 번호 001을 설정하여 이미지의 명명 순서를 시작합니다. 이미지 형식(Image Format)의 유형(Type)에서 JPEG(*.jpg)를 선택하여 파일 형식을 JPEG로 설정하고 옵션(Options)을 클릭하여 세부 정보를 조정합니다. 압축 수준을 16으로 조정하고 인코딩을 표준으로 조정하고 ICC 프로파일 포함을 선택하여 이미지 형식 품질을 설정합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다(그림 2B).
   3. 첫 번째 옵션을 선택하지 않은 상태로 두고("같은 이름의 파일 덮어쓰기") 다음 3가지 옵션("다음 스캔 전에 이 대화 상자 표시", "스캔 후 이미지 폴더 열기" 및 "스캔 후 페이지 추가 대화 상자 표시")을 선택합니다. 확인 을 클릭하여 창을 닫습니다
   4. 미리보기를 클릭하여 이미지 품질을 확인하십시오. 미리보기 창이 나타나고 스캔 아이콘이 작동합니다(그림 2C).
4. 스크립팅 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득을 자동화합니다. 제공된 스크립트는 스캔 창에서 스캔을 클릭하고 파일 저장 설정 창에서 30분 간격으로 확인을 클릭합니다.
   1. Task | Single_scan.tsk 및 Idle_scanning.tsk를 모두 가져와 선택합니다. 그림 2D를 참조하십시오. 참고: Single_scan.tsk는 스캔 창에서 스캔 버튼을 클릭하고 파일 저장 설정 창에서 확인을 클릭합니다. Idle_scanning.tsk은(는) 30분마다 Single_scan.tsk를 활성화합니다. Idle_scanning.tsk의 활성화를 변경하여 스캔 빈도를 변경할 수 있습니다.
   2. 유휴 스캔(가져오기)과 단일 스캔(가져오기)을 모두 선택하고 유휴 스캔(가져오기)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 활성화를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 30분 간격으로 자동 스캔을 활성화합니다(그림 2D).

메모: 자동 검사는 사용자가 스크립트를 수동으로 중지할 때까지 실행됩니다. 스크립트를 중지하려면 유휴 스캔(가져옴)을 선택하고 유휴 스캔(가져오기)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 사용을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 확인 표시가 제거됩니다.

2. 타임랩스 이미지 컴파일 및 군집 반발력 측정

1. ImageJ를 사용하여 동영상 편집 및 이미지 분석을 수행합니다.
2. 파일 | 가져오기 | 이미지 시퀀스를 클릭하고 이미지를 선택합니다. 시퀀스 옵션 창에서 RGB로 변환을 선택하여 이미지를 컬러로 유지합니다. 이미지 수는 선택한 이미지 수를 나타냅니다.
3. 폴더의 첫 번째 사진부터 시작하려면 시작 이미지를 1로 유지하고 이미지의 원래 크기를 보존하려면 이미지 크기를 100%로 조정합니다. 가상 스택 사용을 선택하지 않은 상태로 둡니다. OK( 확인) 를 클릭하고 이미지가 로드될 때까지 기다립니다(그림 3A).
4. 편집 | 옵션 | 입력/출력... JPEG 품질을 100으로 조정합니다.
5. 파일 |.avi 다른 이름으로 저장 | AVI입니다. 압축을 JPEG로 조정하고 프레임 속도를 5fps로 조정합니다(그림 3B). .avi 타임랩스를 원하는 폴더에 저장합니다.
6. 떼 반발 거리를 정량화하려면 ImageJ에서 떼 기간이 끝날 무렵 이미지를 엽니다. 파일 | 이미지를 열고 선택합니다. 분석 | 배율을 설정 하고 픽셀 단위의 거리를 118로, 알려진 거리를 1로, 픽셀 종횡비 를 1.0으로, 길이 단위를 cm로 설정합니다(그림 3C). Global 을 선택하지 않은 상태로 둡니다. 확인 을 클릭하여 창을 닫습니다.
7. 직선 아이콘을 클릭하고 위성 위치의 식민지 중심에서 떼를 지어 모이는 개체군의 가장자리까지 측정합니다. 분석 | 측정값(길이)과 함께 새 창이 나타나도록 측정합니다(그림 3D). 메모: "+"를 사용하여 더 가깝게 확대하고 "-"를 사용하여 축소합니다.

결과

그림 1: 인큐베이터 내부의 스캐너 설정. (A) 검은색 페트리 접시 뚜껑. 이 뚜껑은 스캐닝 중에 빛 반사를 줄이고 투명한 페트리 접시 뚜껑을 대체하는 데 사용됩니다. (B) 평판 문서 스캐너를 37°C로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 검은색 뚜껑이 있는 6개의 플레이트를 스캐너 위에 놓습니다(왼쪽 이미지). 스캐너 위 60cm 랙에 검은색 무광택 패브릭이 부착되어 반사...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
박토 한천, 탈수	BD 디프코	214010	LB-한천 플레이트 및 군집 한천 플레이트용
카사미노산	BD 디프코	223050	떼 매체용
D-포도당	피셔 케미칼	D16500	포도당. 떼 매체용
황산마그네슘 칠수화물	시그마-알드리치	230391	떼 매체용
인산칼륨 일염기성	시그마-알드리치	P0662	5X M8 용지용
소금	시그마-알드리치	S9888	5X M8 용지용
인산나트륨 이염기성 칠수화물	피셔 케미칼	S373	5X M8 용지용
변종
녹농균	시랴폰 연구실	AFS27E.118	PA14 균주
공급
블랙 스프레이 페인트	크릴론	5592 매트 블랙	검은색 뚜껑용
8인치 지퍼 타이	가드너 벤더	E173770	블랙 매트 원단 부착용
페트리 접시 (100mm x 15mm)	어부	FB0875712	100 x 15mm 폴리스티렌 플레이트
설비
이미지J	NIH	v1.52a	이미지 분석용 소프트웨어
부 화기	VWR	89032-092	37°C에서 박테리아 증식용
스캐너	엡손	엡손 퍼펙션 V370 사진	이미징 플레이트용 스캐너
스캐너 자동화 소프트웨어	로보태스크 라이트	버전 7.0.1.932	30분 내부 이미징용
스캐너 이미지 획득 소프트웨어	엡손	v9.9.2.5미국	이미징 플레이트용 소프트웨어