Vibrio parahaemolyticus의 군집 세포로의 분화 유도

초록

출처: Heering, J., et al. Vibrio parahaemolyticus 수영 및 떼 세포의 세포 분화 유도 및 단일 세포 이미징. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 특별히 준비된 한천 배지를 사용하여 Vibrio parahaemolyticus 에서 군집 세포 분화 유도를 보여줍니다. 철분 고갈, 칼슘 보충 및 표면 접촉과 같은 환경 신호를 조작함으로써 박테리아는 수영 형태에서 측면 편모가 있는 길쭉한 떼 세포로 전환하도록 자극됩니다. 이러한 분화된 세포는 고체 표면 전체에 퍼져 성공적인 형태학적 변화를 의미하는 특징적인 군집 플레어를 형성합니다.

프로토콜

1. 군집 세포 분화 유도

메모: 다음 단계에서는 V. parahaemolyticus 의 군집 세포 수명주기로 분화를 유도하는 방법과 고체 표면에서 증식을 자극하는 방법을 설명합니다.

1. 스웜 플레이트를 준비하기 위해 100mL ddH₂O에 심장 주입(HI) 한천 4g을 현탁시킵니다.

2. HI 한천 용액을 전자레인지에 조심스럽게 끓이고 분말이 녹을 때까지 병을 수시로 흔듭니다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.

3. 고압멸균 후 HI 한천을 60-65°C로 식히고 2,2'-비피리딜을 최종 농도 50μM(100% 에탄올에 50mM의 원액)으로 첨가합니다. CaCl₂ 를 4mM의 최종 농도(ddH₂O에서 4M의 원액)에 첨가합니다. 필요한 경우 플라스미드를 유지하기 위해 용액에 항생제를 첨가하십시오.

메모: 유도성 플라스미드를 사용할 계획이라면 유도제를 최종 농도까지 첨가하십시오.

주의: 2,2'-비피리딜: 급성 독성(경구, 경피, 흡입). 이 화학 물질을 다룰 때는 장갑과 보안경을 사용하십시오.

4. 최종 HI 한천 용액 30 - 35mL를 둥근 150mm 페트리 접시에 붓고 한천을 응고시킵니다.

5. 세포 배양을 발견하기 직전에 한천 플레이트를 37°C에서 최소 10분 동안(또는 액체 잔류물이 사라질 때까지, 더 이상 제거되지 않음) 뚜껑을 열어 똑바로 세웁니다.
메모: 건조 시간은 사용된 인큐베이터에 따라 크게 달라지며 심하게 건조된 플레이트는 V. parahaemolyticus의 떼를 허용하지 않습니다. (이 단계는 매우 중요합니다!) 접시는 신선하게 사용해야 하며 2 - 3시간을 넘지 않아야 합니다. 오래된 접시는 너무 건조하여 떼를 지어 모임을 자극할 수 없습니다.

6. 단일 콜로니의 가장자리에서 소량의 세포를 5mL의 Luria-Bertani(LB) 국물에 접종합니다. OD₆₀₀ = 0.8에 도달할 때까지 37°C에서 배양을 흔들며 배양하면 일반적으로 약 2-3시간이 소요됩니다. 그 후, 세포는 HI 떼 한천 플레이트에 발견될 준비가 됩니다.

7. HI 한천 떼 플레이트의 중앙에 세포 배양 1μL를 배치합니다(그림 1A).

8. 반점을 말리십시오(그림 1B).

9. 투명 플라스틱 테이프로 플레이트를 밀봉하고 단단히 부착되었는지 확인하지 않으면 하룻밤 배양 중에 분리될 수 있습니다(그림 1C).

메모: 씰이 완벽한 것이 매우 중요합니다. 테이프를 붙일 때 기포가 생기고 테이프에 접히지 않도록 하십시오.

10. 플레이트를 24°C에서 밤새 배양합니다. 이로 인해 군집 군집의 주변에서 확장되는 군집 플레어가 있는 V. parahaemolyticus 군집 군집이 형성됩니다(그림 2).

결과

그림 1: 군집 분화 유도 및 현미경 이미징을 위한 세포 준비. V. parahaemolyticus 떼 세포를 생산하기 위한 워크플로의 시각화 및 단일 떼 세포의 현미경 분석을 위한 현미경 슬라이드 준비를 단순화했습니다. (A) HI 한천 떼 플레이트의 중심에 V. parahaemolyticus의 OD₆₀₀ = 0.8 세포 배양 1μL를 스팟. (B) 스...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미디어 구성 요소
LB 미디엄	로스	엑스968.3
Difco 한천, 과립	BD	214510	LB 배지를 이용한 LB 한천 제조용
Difco 심장 주입 한천	BD	244400	HI 한천 떼 플레이트 준비용
아가로스 NEEO, 울트라 품질	로스	2267.3	현미경 아가로스 패드 제조용
첨가제
2,2'-비피리딜	시그마 알드리치	D216305-25G	HI 한천 떼 플레이트 준비용
염화칼슘 이수화물	로스	5239.1	HI 한천 떼 플레이트 준비용
하드웨어
페트리 접시 150mm x 20mm(캠 포함)	사르슈테트	82.1184.500	HI 한천 떼 플레이트 준비용
켈비트론 T (B 6420)	헤레우스	-	HI 한천 떼 플레이트 건조에 사용