식물 세포의 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달 모니터링

초록

출처: Lee, H. et. al., 감염 중 박테리아로부터 전달되는 이펙터를 시각화하기 위한 녹색 형광 단백질 시스템 분할. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 공초점 현미경과 결합된 분할 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 상보를 사용하여 식물 세포에서 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 이 접근 방식을 통해 숙주 세포 세포질로의 이펙터 전좌를 정확하게 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

메모: 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.

1. 식물 재료 준비(4주)

1. Nicotiana benthamiana 식물 준비
   1. 각 화분의 토양 표면에 N. benthamiana 의 씨앗 2개를 뿌리고 트레이를 플라스틱 돔으로 덮고 25/60시간의 밝은/암광 주기로 16°C, 8% 습도 성장 챔버에서 씨앗이 발아하도록 합니다.
   2. 2주 후 각 화분에서 가장 작은 묘목을 골라서 버립니다. 1.1.1단계에서 발아를 위해 적용한 것과 동일한 성장 조건에서 식물을 계속 재배합니다. 이틀에 한 번씩 트레이당 물 1L를 추가합니다.
      메모: 식물의 성장 조건은 실험실마다 다를 수 있습니다. 따라서 식물을 건강한 상태로 키우려면 정기적인 물주기 프로토콜을 따르십시오.
   3. 일주일 안에 식물을 새 쟁반으로 옮기고 추가 성장을 위한 적절한 공간을 배치하십시오. 1.1.1단계에서 설명된 조건에서 식물이 4주령에 침투할 준비가 될 때까지 식물을 계속 성장시킵니다.
      메모: 식물 성장은 실험실 간의 성장 조건에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 우리는 4주 된 N. benthamiana 식물이 약 6개의 잎을 가지고 있음을 발견합니다.
2. 애기장대 변형 식물 준비
   1. 재료표를 참조하고 형질전환 애기장대 종자를 주문하십시오.
   2. ~50 - 100개의 형질전환 애 기장대 종자를 증류수 1mL에 담그고 발아 시작을 동기화하기 위해 4°C에서 어두운 곳에서 3일 동안 보관합니다.
   3. 플러그 식물 트레이의 토양 표면에 ~2 - 3개의 씨앗을 뿌리고 트레이를 플라스틱 돔으로 덮습니다. 종자가 23°C, 습도 60%에서 10/14시간의 밝은/어두운 광주기로 발아하도록 합니다.
      메모: 씨앗은 동형접합이어야 합니다. 그러나 배치에 이식유전자가 존재하는지 재확인하는 것이 좋습니다. 이 경우 70% 에탄올로 2분, 0.05% Triton X-100을 함유한 50% 표백제(약 2% 차아염소산염)로 5분 동안 세척하여 종자를 살균합니다. 그런 다음 멸균 이중 증류수(ddH₂O)로 5 - 6회 세척합니다. 멸균 후 4°C에서 3일 동안 층화하고 25μg/L의 하이그로마이신 B를 함유한 식물 발아 배지에 도금하여 형질전환 식물을 선택합니다.
   4. 일주일 후에는 플러그당 한 식물만 남겨두고 1.2.3단계에서 사용한 것과 동일한 성장 조건에서 식물을 계속 재배합니다.
      메모: 4주 된 식물은 Pseudomonas syringae 감염에 사용되었습니다. 식물을 건강하게 유지하기 위해 격일로 식물에 물을 줍니다.

2. 슈도모나스 배양 준비(~1주)

1. 슈도모나스 형질전환을 위한 플라스미드 구축
   1. 재료 표를 참조하고 유형 III 분비 시스템(T3SS) 기반 이펙터 전달 시스템 벡터의 원하는 벡터를 주문하십시오.
   2. 부위 특이적 재조합 클로닝을 사용하여 관심 있는 이펙터 유전자를 이펙터 전달 벡터에 삽입합니다.
      메모: 전장 이펙터 단백질의 세포 내 국소화를 모니터링할 때 전장 유전자를 pBK-GW-1-2 또는 pBG-GW-1-2에 넣습니다. 형광 신호 증가를 위해 2x sfGFP11(sfGFP의 11번째 β 가닥)을 포함하는 pBK-GW-1-4 또는 pBG-GW-1-4를 선택할 수도 있습니다. 신호 펩타이드가 없는 부분 이펙터의 경우 pBK-GW-2-2 또는 pBK-GW-2-4를 사용합니다.
2. sfGFP11 태그에 융합된 이펙터를 운반하는 플라스미드를 P. syringae pv로 변환합니다. 토마토 (Pst)는 표준 전기천공법을 사용하여 CUCPB5500합니다.
   메모: 필요한 경우 다른 슈도모나스 균주를 사용할 수 있습니다. sfGFP11 태그 시스템은 광범위한 벡터에 대해 구성되며, 이펙터의 유전자 발현은 예를 들어 슈도모나스 플루오레센 스(EthAn)와 유사한 AvrRpm1 프로모터에 의해 조절됩니다.
3. 형질전환된 박테리아 세포를 100μg/mL 리팜피신과 25μg/mL 카나마이신 또는 25μg/mL 겐타마이신을 함유한 King's B 한천 플레이트의 표면에 부드럽게 펴 바릅니다. 28°C에서 2일 동안 배양합니다.
4. 사용된 벡터에 적합한 항생제를 King's B 액체 배지에 하나의 콜로니에 접종하고 200rpm에서 흔들면서 28°C에서 밤새 세포를 성장시킵니다.
5. 글리세롤 스톡을 만드십시오. 고압멸균된 글리세롤을 최종 농도 50%까지 첨가하고 -80°C에서 보관합니다.

3. N. benthamiana에서 소기관 표적 sfGFP1-10^OPT(sfGFP의 1-10번째 β-가닥)의 일시적 발현 (4일)

1. 아그로박테리움 배양 준비
   1. 소기관 표적 sfGFP1-10^OPT 플라스미드의 원하는 벡터를 주문합니다( 재료 표 참조).
   2. 플라스미드를 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101 세포로 변환합니다. 50μg/mL 카나마이신 및 50μg/mL 리팜피신이 보충된 Luria-Bertani(LB) 한천 배지에서 28°C에서 2일 동안 세포를 성장시킵니다.
   3. LB 한천 배지의 단일 콜로니에서 50μg/mL 카나마이신 및 50μg/mL 리팜피신이 보충된 5mL의 액체 LB 배지에 세포를 접종합니다. 200rpm에서 흔들면서 28°C에서 밤새 세포를 성장시킵니다.
   4. 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상청액 배지를 붓고 새로 만든 침투 완충액 1mL에 펠릿을 재현탁합니다.
   5. 600nm(Abs 600nm)의 흡광도에서 광학 밀도(OD) 값을 얻어 아그로박테리움 의 양을 측정합니다. 침투 완충액을 사용하여 박테리아의 OD₆₀₀ 을 0.5로 조정합니다.
      참고: 1mL의 현탁액은 두 지점에 침투하기에 충분합니다.
   6. 침투하기 전에 1 - 5시간 동안 부드러운 로커에 배양물을 실온에 두십시오.
   7. 10μL 팁으로 침투할 잎 중앙에 구멍을 뚫습니다. 1mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 아그로박테리움 현탁액에 침투시킵니다. 3.1.5단계에서 준비된 현탁액 약 500μL를 주사기를 통해 잎 부축측에 조심스럽고 천천히 주입합니다. 실험 복제를 위해 적어도 세 개의 다른 식물에 침투를 반복합니다.
      메모: 건강 및 안전상의 이유로 침투 중에는 보안경을 착용해야 합니다.
   8. 잎에 남아 있는 박테리아 현탁액을 닦아내고 침투 부위의 경계를 표시하십시오.
   9. 침투한 식물을 1.1.1단계에서 사용한 것과 동일한 성장 조건에서 2일 동안 보관합니다.

4. 슈도모나스 접종 (4일)

1. 28°C에서 적절한 항생제와 함께 King's B 한천 배지에 2.5단계의 글리세롤 스톡에서 형질전환된 슈도모나스 균주를 28일 동안 줄무늬로 줄무늬로 만듭니다.
   메모: 슈도모나스 의 건강은 매우 중요합니다. 콜로니가 잘 형성되지 않으면 진행하기 전에 세포를 다시 줄무늬로 만들거나 King's 액체 배지에서 세포를 증식시킵니다.
2. 28°C의 만니톨-글루타메이트(MG) 액체 배지에 루프 풀의 슈도모나스 세포를 200rpm에서 밤새 흔들면서 접종합니다.
3. 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상청액 배지를 붓고 펠릿을 10mM MgCl₂에 재현탁한 다음 OD₆₀₀을 N. benthamiana 잎의 경우 0.02(1 x 10⁷ cfu/mL)로, 애기장대 잎의 경우 0.002(1 x 10⁶ cfu/mL)로 조정합니다.
4. N. benthamiana의 경우, sfGFP1-10^OPT 구조물을 운반하는 Agrobacterium이 2일 전에 침투된 잎 영역에 슈도모나스 현탁액을 침투시킵니다(단계 3.1.7에서와 같이). sfGFP1-10^OPT 형질전환 애기장대의 경우, 슈도모나스 현탁액을 4주 된 짧은 낮에 자란 잎 2개에 침투시킵니다.
   메모: 실험 복제를 위해서는 최소 3개의 식물이 필요합니다.

5. 공초점 현미경을 통한 sfGFP 신호 관찰(1일)

1. 슈도모나스에 접종된 잎에서 잎 디스크를 잘라냅니다. 슈도모나스 침투 후 특정 시점에서 40X/1.2 개구수(NA) C-Apochromat 침수 대물렌즈 또는 63X/0.8 NA C-Apochromat 오일 침지 대물렌즈가 있는 레이저 스캐닝 공초점 시스템을 사용하여 단일 식물에서 2cm² 잎 디스크 2개를 이미지화합니다. 상처로 인해 죽은 세포가 죽는 것을 방지하려면 침윤 구멍에서 멀리 떨어진 세포를 관찰하십시오.
2. 488nm 아르곤 레이저의 저전력 설정에서 관찰을 시작합니다. 레이저 출력을 높여 sfGFP를 감지합니다.
   메모: 우리는 일반적으로 레이저 강도의 2 - 15%를 사용하여 형광 신호를 감지합니다. 그러나 레이저 출력 및 감지 설정은 사용자의 현미경 시스템에 따라 조정되어야 합니다. 여기서 방출 필터는 520 - 550nm로 설정되었습니다. 죽은 세포는 종종 488nm 레이저 여기 하에서 자동 형광을 방출합니다. 따라서 음성 대조군으로서 sfGFP11 태그가 없는 동일한 이펙터를 침투시켜 동일한 관찰 조건에서 관찰해야 합니다. 또한 높은 레이저 여기는 엽록소 자가형광을 유도할 수 있습니다. 따라서 엽록소 자가형광을 유도하지 않도록 대조군 식물 세포를 사용하여 레이저 강도를 조정하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
애기장대 형질전환 계통			Park, E., Lee, HY, Woo, J., Choi, D. &; Dinesh-Kumar, SP 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 이펙터의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
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소기관 표적 sfGFP1-10OPT 플라스미드			Park, E., Lee, HY, Woo, J., Choi, D. &; Dinesh-Kumar, SP 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 이펙터의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
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t3SS 기반 이펙터 전달 시스템을 위한 sfGFP11 태그 게이트웨이 호환 벡터	Park, E., Lee, HY, Woo, J., Choi, D. &; Dinesh-Kumar, SP 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 이펙터의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
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박테리아 균주
아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101			Csaba Koncz 및 Jeff Schell, TL-DNA 유전자 5의 프로모터는 새로운 유형의 Agrobacterium 이진 벡터에 의해 운반되는 키메라 유전자의 조직 특이적 발현을 제어합니다. 몰 젠 제넷. 204,383-396 (1986); 겐타마이신(50ug/ml) 및 리팜피신(50ug/ml)에 내성
슈도모나스 시린지 pv. 토마토 CUCPB5500			크비트코, BH 외. Pseudomonas syringae pv. 토마토 DC3000 III형 분비 이펙터 유전자는 이펙터 간의 기능적 중복을 나타냅니다. PLoS 병원. 5 (4) (2009).; 리팜피신(100ug/ml)에 내성
미디어 구성 요소
식물 발아 배지			물에 무라시게 & 스쿠그 분말 2.165g/L, 자당 10g/L를 첨가합니다. pH 5.8로 조정하고 2.2g/L 피타젤을 첨가합니다. 오토카브.
Murashige & Skoog 미디엄 포함	두셰파 생화학	엠0222	4°C에서 보관하십시오.
자당	두셰파 생화학	에스0809
피타젤	시그마-알드리치	피8169
LB 미디어			물에 트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L을 첨가합니다. 고체 배지의 경우 15g/L 마이크로 한천을 추가합니다. 오토 클레이 브. 용액을 55°C로 식히고 필요한 경우 항생제를 첨가합니다.
트립톤	BD 생명과학	211705
효모 추출물	BD 생명과학	212750
나크롬	두셰파 생화학	S0520
마이크로 한천	두셰파 생화학	M1002
킹스 B 미디어			10g/L 프로테아제 펩톤 #2, 1.5g/L 무수 K2HPO4, 한천 15g/L를 물에 담았습니다. 오토 클레이 브. 55°C로 냉각하고 멸균 15ml/L 글리세롤, 5ml/L MgSO4 를 배지에 첨가합니다. 필요한 경우 항생제를 추가하십시오.
프로테오스 펩톤	BD 생명과학	212120
무수 K2HPO4	시그마-알드리치	USP 1551128
글리세롤	두셰파 생화학	지1345
MgSO4	시그마-알드리치	M7506
박토 한천	BD 생명과학	214010
만니톨-글루타메이트(MG) 액체 배지			물에 만니톨 10g/L, L-글루탐산 2g/L,KH2PO4 0.5g/L, NaCl 0.2g/L, MgSO4 0.2g/L를 첨가합니다. pH 7로 조정
만니톨	두셰파 생화학	M0803
L-글루탐산	두셰파 생화학	지0707
KH2PO4	시그마-알드리치	NIST200B
침투 완충액			10 mM MES (2-(N-모르폴리노)-에탄 설폰산), 10 mM MgCl2, 150 μM 아세토시린곤. pH 5.6; 사용하기 전에 새로운 완충액을 준비하십시오.
MES	두셰파 생화학	M1503	물에 100mM(pH 5.6) 스톡을 준비합니다. 필터 살균.
MgCl2	시그마-알드리치	M8266	물에 100mM 스톡을 준비합니다. 오토 클레이 브.
아세토시린곤	시그마-알드리치	D134406	DMSO에 150mM 스톡을 준비합니다.
공초점 현미경 장비/재료
710 레이저 스캐닝 공초점 시스템	칼 자이스
Axio 관찰자 Z1 도립 현미경	칼 자이스