Light-patterned Hydrogel Degradation을 사용한 표적 박테리아 콜로니 분리

Abstract

출처: Fattahi, N., et al. 박테리아 스크리닝, 선택 및 분리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스. J. Vis. 경험. (2021).

이 비디오는 UV 광선을 사용하여 광분해성 하이드로겔에서 박테리아 콜로니를 추출하는 방법을 보여줍니다. 특정 콜로니가 선택되고 패턴화된 빛 노출이 국부적인 하이드로겔 분해를 시작하도록 설계되었습니다. 빛의 강도와 지속 시간을 조정한 후 UV 광선이 적용되어 콜로니가 방출됩니다. 그런 다음 콜로니는 튜브를 통해 흡인되고 다운스트림 분석을 위해 튜브로 옮겨집니다.

Protocol

1. 박테리아 균주 및 배양 프로토콜

1. 적절한 성장 배지로 보충된 한천 플레이트의 박테리아 줄무늬 콜로니. 본 보고서에서, B. subtilis (균주 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center)를 ATGN (0.079 M KH₂PO₄ (인산이수소칼륨), 0.015 M (NH₄)₂SO₄ (황산암모늄), 0.6 mM MgSO₄·7H₂O (황산마그네슘 칠수화물), 0.06 mM CaCl₂·2H₂O (염화칼슘 이수화물), 0.0071 mM MnSO₄·H₂O (황산망간(II) 일수화물), 100μg/mL 암피실린이 보충된 ATGN 한천 플레이트에 100μg/mL 스펙티노마이신 및 대장균(균주 25922, ATCC)이 보충된 0.125 M FeSO₄·7H₂O(황산제일철 칠수화물), 28 mM 포도당, pH: 7 ± 0.2, 15 g/L 한천 플레이트.
   참고: 이러한 물질로 하이드로겔 캡슐화 및 방출에 대한 이전 보고에서는 A. tumefaciens C58 세포를 사용했습니다.
2. ATGN 한천 플레이트에서 원하는 콜로니를 선택하고 하룻밤 배양을 시작합니다. 여기에 사용된 대장균 및 B. subtilis 균주의 경우, ATGN 액체 배지에서 215rpm으로 24시간 동안 흔들면서 37°C에서 배양합니다. 나중에 사용할 때까지 세포 배양액을 -80°C의 50% 글리세롤에 보관합니다.
3. 멸균 접종 루프를 사용하여 글리세롤 스톡에서 두 균주의 콜로니를 선택하고 ATGN 액체 배지에서 37°C 및 215rpm에서 24시간 동안 배양합니다.

2. 하이드로겔 형성에 필요한 재료의 준비

1. 광분해성 PEG-o-NB-디아크릴레이트(폴리(에틸렌글리콜)-오르토-니트로벤질-디아크릴레이트) 합성
   참고: PEG-o-NB-디아크릴레이트의 사내 합성은 잘 설명되었으며 이전에 보고되었습니다. 또는 합성이 일상적이기 때문에 화학 합성 시설에서 아웃소싱할 수 있습니다.
2. 가교 완충액
   1. 박테리아 균주에 대해 선택한 배지의 레시피를 취하고 2배의 영양소로 배지를 준비합니다. 인산염, 예를 들어, NaH₂PO₄ (인산이수소나트륨)를 배지에 최종 농도 100 mM로 첨가한다. 그런 다음 5M NaOH(수산화나트륨)(수성)를 사용하여 pH 값을 8로 조정합니다.
   2. 완충 용액을 멸균하고 추가 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
      참고: 매질에 존재하는 전이 금속은 티올의 이황화물로의 산화를 촉매하므로 배지에 존재하는 모든 금속을 제외하십시오.
3. PEG-o-NB-디아크릴레이트 용액
   1. 분취량 PEG-o-NB-디아크릴레이트(분자량 3,400Da) 분말의 각 mg에 대해 3.08μL의 초순수를 첨가하여 49mM 농도의 PEG-o-NB-디아크릴레이트(98mM 아크릴레이트 농도)에 도달합니다.
   2. 용액이 잘 섞일 때까지 소용돌이치고 추가 사용할 때까지 이 용액을 -20°C에서 보관합니다.
4. 4-arm PEG-티올 용액
   1. 4-arm PEG-thiol(10,000 Da 분자량) 준비의 경우 분말 mg당 초순수 4 μL를 첨가하여 20 mM 농도(티올 농도 80 mM)에 도달합니다.
   2. 이 용액이 잘 섞일 때까지 소용돌이치고 추가 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.

3. 과불화알킬화(비반응성) 커버슬립의 제조

1. 폴리프로필렌 슬라이드 메일러 안에 최대 5개의 유리 슬라이드(25mm x 75mm x 1mm)를 넣습니다. 2% (w / v) 세제 용액 (재료 표)으로 슬라이드를 20 분 동안 초음파 처리합니다.
2. 슬라이드를 초순수로 세 번 헹구고 슬라이드를 물에 20 분 동안 초음파 처리합니다. N₂ (질소)의 흐름을 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다.
3. 섹션 4.1의 프로토콜에 따라 유리 슬라이드의 양쪽에 있는 플라즈마 세척( 재료 표 참조)을 2분 동안 세척합니다.
4. 플라즈마 세척 슬라이드를 슬라이드 메일러에 다시 넣고 톨루엔 내 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H, -퍼플루오로옥틸) 실란의 0.5% (v/v) 용액으로 용기를 채웁니다. 이 유리 슬라이드가 실온(RT)에서 3시간 동안 기능화되도록 합니다.
5. 슬라이드가 기능화된 후 슬라이드 메일러 내에서 슬라이드를 먼저 톨루엔으로, 다음으로 에탄올(각 용매로 3회)으로 헹굽니다. 다음으로, 기능화된 각 슬라이드를 N₂의 흐름으로 건조시킵니다.

4. 티올 기능화(베이스) 커버슬립의 제조

1. 플라즈마 클리너를 사용한 유리 커버슬립 청소
   1. 페트리 접시에 18mm x 18mm 커버슬립을 놓습니다. 그런 다음 페트리 접시를 플라즈마 클리너 챔버에 넣고 플라즈마 클리너의 전원을 켭니다.
   2. 압력 게이지가 400mTorr가 될 때까지 진공 펌프를 켜서 챔버 내의 공기를 정화합니다.
   3. 계량 밸브를 열어 압력 게이지가 일정한 압력(800-1000mTorr)에 도달할 때까지 챔버에 공기를 유입시킵니다. 그런 다음 "Hi" 모드로 RF를 선택하고 커버슬립을 3분 동안 노출시킵니다.
   4. 3분 후 RF 모드와 진공 펌프를 끕니다.
   5. 페트리 접시를 챔버에서 꺼내고 커버슬립을 뒤집어 챔버에 다시 플라즈마에 놓고 유리 커버슬립의 다른 쪽을 노출시킵니다.
   6. 4.1.2-4.1.4단계를 반복하여 유리 커버슬립의 처리되지 않은 면을 플라즈마로 청소합니다.
   7. 공정이 완료되면 챔버에서 페트리 접시를 제거하고 플라즈마 클리너와 진공 펌프를 끕니다.
2. 피라냐 용액을 사용한 커버슬립의 세척 및 수산화
   알림: 표준 피라냐 세척 프로토콜을 사용하여 유리 슬립을 세척하고 수산화할 수 있습니다. 피라냐 용액은 H₂O₂ (과산화수소)와 H₂SO₄ (황산)의 30:70(v/v) 혼합물입니다. 유리 커버슬립을 청소하는 다른 방법도 사용할 수 있습니다.
   주의: 피라냐 용액은 유기 용매에 대한 강한 부식성 및 폭발성이 있으므로 극도의 주의를 기울여 취급해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운, 내화학성 앞치마, 보안경, 안면 보호대, 내산성 부틸 장갑)의 사용과 같은 적절한 안전 및 봉쇄 조치를 구현해야 합니다. 피라냐 용액과 접촉하는 모든 유리 제품과 작업 표면은 사용하기 전에 깨끗하고 건조해야 하며 유기 잔류물이 없어야 합니다. 피라냐 용액은 부분적으로 밀폐되거나 밀폐된 용기에 보관해서는 안 됩니다.
   1. 깨끗한 100mm x 50mm 유리 접시를 휘감 후드 아래의 교반 속도를 조절할 수 있는 핫플레이트 마그네틱 교반기에 놓고 접시에 H₂SO₄ 14mL를 추가합니다.
   2. 테프론 코팅 겸자를 사용하여 작은 테프론 코팅 마그네틱 교반 막대를 접시 내부에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 산이 튀지 않도록 교반기를 천천히 돌립니다.
   3. 그런 다음 접시에 H₂O₂ 6mL를 부드럽게 넣고 용액이 잘 섞이도록 합니다.
   4. 교반기를 끈 다음 집게를 사용하여 접시에서 교반 막대를 제거합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 접시 안에 커버슬립을 부드럽게 놓고 온도를 60-80°C로 설정합니다.
   5. 30분 후 집게를 사용하여 커버슬립을 부드럽게 제거하고 탈이온수(DI) 물에 두 번 담가 잔류 피라냐 용액을 씻어냅니다.
   6. 물로 헹군 후 커버슬립을 RT에서 DI 물에 보관하십시오.
   7. 핫플레이트를 끄고 피라냐 용액을 식히십시오.
   8. 피라냐 용액을 폐기하려면 냉각된 피라냐 용액이 들어 있는 100mm x 50mm 유리 접시를 부피가 1.5L 이상인 더 크고 빈 유리 비커에 부드럽게 넣습니다. 그런 다음 물 1L를 첨가하여 희석하고 중탄산나트륨 분말을 첨가하여 중화시킵니다. 중탄산나트륨은 기포와 열 발생을 유발하므로 매우 천천히 첨가해야 합니다. 그렇지 않으면 거품이 발생하여 산이 튀는 현상이 발생할 수 있습니다. 중탄산나트륨을 추가로 첨가해도 기포가 발생하지 않으면 pH 종이로 pH를 확인하여 중화되었는지 확인하십시오. 용액이 중화되고 냉각되면 싱크대 아래로 부을 수 있습니다.
3. 커버슬립의 티올 기능화
   1. 건조 톨루엔에 269mM의 (3-메르캅토프로필) 트리메톡시실란(MPTS) 용액의 5%(v/v) 용액을 준비합니다.
   2. 개별 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 용액 10mL를 추가합니다. 청소한 커버슬립 하나를 각 튜브에 넣고 용액에 담그십시오.
      참고: 50mL 튜브당 하나의 커버슬립은 다른 기질에 의해 방해받지 않고 기질 양면의 티올화를 보장하는 데 사용됩니다.
   3. 4시간 후, 각 커버슬립(커버슬립당 4회 세척)을 톨루엔, 1:1(v/v) 에탄올: 톨루엔 혼합물 및 에탄올로 세척합니다.
      참고: 이것은 각 커버슬립을 언급된 용액이 들어 있는 원추형 원심분리기 튜브에 순차적으로 담그면 수행됩니다.
   4. 기질을 헹군 후 에탄올에 담그고 추가 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
      참고: 커버슬립의 수에 따라 이 방법은 커버슬립을 한 번에 하나씩 처리하기 때문에 힘들 수 있습니다. 여러 커버슬립의 경우 동시에 여러 커버슬립에 맞는 Columbia 항아리를 사용할 수 있습니다.

5. 실리콘 마이크로웰 어레이 제작

1. 파릴렌 코팅: 이전 연구 기사에서 설명한 표준 프로토콜을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 파릴렌으로 코팅합니다.
2. 미세 가공: Barua et al.이 설명한 프로토콜에 따라 마이크로웰 어레이를 설계하고 제작합니다. ​

6. 하이드로겔 형성

1. 유리 커버슬립에 벌크 하이드로겔 형성
   1. 하이드로겔 전구체 용액: 0.5mL 미세 원심분리기 튜브에 가교 완충액 12.5μL를 첨가한 다음 PEG-o-NB-디아크릴레이트 용액 5.6μL를 첨가합니다. 마지막으로 혼합물에 6.9μL의 4-arm PEG-thiol 용액을 첨가합니다.
      참고: 혼합물에 4-arm PEG 티올을 첨가하면 가교 반응이 시작됩니다. 따라서 하이드로겔 전구체 용액은 혼합 직후 사용해야 합니다.
   2. 하이드로겔 전구체 용액에 세포를 캡슐화하려면 6.1.3-6.1.9단계를 따르십시오.
   3. 세포 캡슐화의 경우, 6.1.1단계 전에 가교 완충액에 원하는 세포 밀도를 접종한다. 이전에 보고된 바와 같이19, 가교 완충액에서 7.26 × 10⁷ CFU/mL의 세포 밀도는 하이드로겔을 가로질러 캡슐화된 ~ 90 세포/^mm2 의 밀도와 상관관계가 있는 것으로 관찰되었다.
   4. 티올 처리된 베이스 커버슬립을 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다. 커버슬립의 반대쪽 두 면에 두 개의 스페이서( 재료 표 참조)를 놓습니다.
      참고: 커버슬립의 티올 기능화는 하이드로겔을 커버슬립 표면에 공유 결합하는 데 필요합니다. 이것은 표면의 티올 그룹과 하이드로겔 전구체 용액에 존재하는 아크릴레이트 그룹의 반응을 통해 수행됩니다.
   5. 스페이서를 페트리 접시에 테이프로 붙여 베이스 커버슬립에 스페이서를 고정합니다.
   6. 비반응성 과불화알킬화 유리 슬라이드에서 원하는 부피의 전구체 용액을 피펫팅합니다.
   7. 과불화알킬화 유리 슬라이드를 베이스 커버슬립에 놓습니다(그림 1C). 하이드로겔 형성이 완료될 때까지 RT에서 25분 동안 기다립니다.
   8. 겔화 후 과불화알킬화 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다. 하이드로겔은 베이스 커버슬립에 부착된 상태로 유지됩니다. ​
      참고: 12.7μm 두께의 멤브레인을 얻기 위해 18mm x 8mm 커버슬립의 경우 ~7μL의 전구체 용액을 사용합니다(그림 1A, B). 더 많은 양의 전구체 용액을 사용하면 베이스 커버슬립 아래에 하이드로겔이 생성될 수 있습니다. 이로 인해 베이스 커버슬립이 페트리 접시에 달라붙어 제거를 시도할 때 파손될 수 있습니다. 또한 커버슬립 아래의 하이드로겔 잔류물은 현미경 검사에 문제가 됩니다. 빠른 제거는 하이드로겔을 손상시킬 수 있으므로 비반응성 과불화알킬화 유리 슬라이드를 부드럽게 제거해야 합니다.
   9. 기질을 지정된 배양 배지의 60mm x 15mm 페트리 접시에 넣습니다. 여기서, 37°C에서 B. subtilis 에 대해 100μg/mL 스펙티노마이신 또는 대 장균 에 대해 100μg/mL 암피실린을 보충한 ATGN 배지를 24시간 배양 시간 동안 사용하였다.

7. 세포 추출을 위한 재료 준비

1. PDMS(폴리디메틸실록산) 홀더 준비
   1. 18 x 18mm 커버슬립 10개를 테이프로 붙이고 이 커버슬립 스택을 페트리 접시 바닥에 붙입니다.
   2. PDMS 홀더를 제작하려면 플라스틱 컵에 PDMS 전구체와 경화제를 10:1의 부피 비율로 혼합하고 진공 데시케이터에서 혼합물을 탈기한 다음 혼합물을 페트리 접시에 붓습니다.
   3. 80°C에서 90분 동안 PDMS를 경화합니다. 그런 다음 테이프로 고정된 블록 주위를 잘라 PDMS 홀더를 제거하고 현미경 검사를 위해 더 쉽게 다룰 수 있도록 PDMS 홀더를 유리 슬라이드 위에 놓습니다.
2. 마이크로 시린지 및 튜브 준비
   1. PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 튜브(0.05인치 내경)를 20cm로 절단하고 튜브의 한쪽 끝을 100μL 마이크로리터 주사기에 부착합니다.
      참고: 추출의 경우 피펫 팁을 통해 방출된 세포를 끌어당기면 하이드로겔 표면이 손상되고 오염될 수 있으므로 피펫을 사용하지 마십시오.

8. 패턴 조명 도구를 사용한 하이드로겔 분해

1. 현미경을 켭니다( 재료 표 참조). 그런 다음 패턴화된 조명 도구를 켭니다( 재료 표 참조).
2. 365nm LED 광원 아날로그 및 디지털 제어 모듈을 켭니다. 그런 다음 LED 광원 제어 모듈을 켭니다.
3. 현미경 소프트웨어와 패턴 조명 도구용 소프트웨어를 엽니다. 하드웨어 구성 창이 열리면 로드 단추를 선택합니다.
   참고: 여기에 세 개의 장치가 로드됩니다. (타사 카메라, 제어 모듈 및 패턴 조명 도구)
4. 시작 버튼을 누릅니다. 이제 라이트 패터닝 소프트웨어 창이 열립니다. 창의 왼쪽 사이드바에서 첫 번째 옵션인 장치 제어 버튼을 선택합니다.
5. 패턴화된 조명 도구를 보정합니다.
   알림: 보정은 빛 노출에 사용할 것과 동일한 현미경 대물렌즈와 필터로 수행해야 합니다.
   1. 현미경 대물렌즈를 10배 배율로 설정합니다.
      참고: 이 배율은 현미경 렌즈와 샘플 표면 사이에 충분한 작동 거리를 허용합니다. 또한 이미지 창을 통해 검색 프로세스를 실시간으로 모니터링하고 기록할 수 있습니다.
   2. 현미경 렌즈와 필터를 빛 노출에 사용되는 설정으로 설정하고 교정 거울을 현미경 아래에 놓습니다.
   3. 장치 제어 창에서 LED 제어 탭을 누릅니다. LED #1을 켜고 광도를 원하는 숫자로 설정합니다. 표준 추출 실험에서는 이 비율이 60%로 설정됩니다.
   4. 장치 제어 창에서 패턴 조명 도구 제품 이름이 있는 탭을 누릅니다. 그런 다음 그리드 표시 버튼을 누릅니다.
      알림: 그리드 패턴이 보정 미러에 투영됩니다.
   5. 현미경 초점과 카메라 노출을 조정하여 그리드의 높은 이미지 품질을 얻고 필요한 경우 카메라를 회전하여 그리드 라인을 카메라 창 프레임과 평행하게 정렬합니다.
   6. 패턴화된 조명 도구 제품 이름이 있는 탭 아래에서 캘리브레이션 마법사 버튼을 선택하고 이 창에서 소프트웨어에서 제공하는 지침을 따릅니다. 참고: 타사 카메라 설정 창이 열립니다.
   7. 캘리브레이션 유형 선택 창이 열립니다. 자동 보정을 선택하고 다음을 누릅니다.
   8. 사전 보정 조정 창이 열리면 소프트웨어 지침에 따라 다음 버튼을 누릅니다.
   9. 매핑 정보 창이 열리면 이 보정을 원하는 폴더에 적절하게 저장합니다. 이것은 날짜, 현미경 이름, 대물 렌즈 및 필터를 입력하여 수행됩니다.
   10. 보정 후 패턴화된 조명 도구 제품 이름이 있는 탭 아래에 있는 작업 영역 정의 버튼을 눌러 필요한 경우 패턴화된 조명 도구의 작업 영역을 정의합니다.
6. 패턴 준비를 위한 시퀀스 디자인 섹션.
   1. 소프트웨어 창의 왼쪽 사이드바에 있는 시퀀스 디자인 버튼을 누릅니다. 그런 다음 프로파일 시퀀스 편집기 버튼을 누릅니다.
   2. 프로파일 시퀀스 편집기(Profile Sequence Editor) 창이 열리면 프로파일 목록(Profile List) 아래에서 새 프로파일(New Profile) 옵션을 선택합니다.
      참고: 이제 패턴 편집기 창이 열립니다.
   3. 원하는 경우 다양한 패턴 모양과 크기를 선택하거나 패턴을 수동으로 그려 빛 노출을 위해 원하는 패턴을 준비합니다.
   4. 벌크 하이드로겔의 원 및 깨진 십자 패턴의 경우 8.6.5-8.6.6단계를 따르십시오.
   5. 원 패턴의 경우 전체 콜로니를 덮기 위해 표적 박테리아 콜로니 위에 직경 30μm의 원을 정의합니다. 모양 채우기 색상을 흰색으로 선택합니다.
   6. 깨진 십자 패턴의 경우 패턴 그리기 창에서 3 μm x 8 μm 크기의 직사각형 모양을 선택합니다. 대상 콜로니의 가장자리에 이러한 치수를 가진 4개의 직사각형을 배치하고 패턴의 절반은 콜로니와 오버레이됩니다.
   7. 마이크로웰 어레이의 원 및 링 패턴의 경우 8.6.8-8.6.10단계를 따르십시오.
   8. 원 패턴의 경우 우물 둘레 주위에 직경 10μm의 원을 그립니다. 모양 채우기 색상을 흰색으로 선택합니다.
   9. 링 패턴의 경우 직경 20μm의 원을 그려 우물 위에 놓고 모양을 선택합니다 채우기 색상 흰색.
   10. 채우기 모양 색상이 검은색인 직경 10μm의 또 다른 원 패턴을 그리고 우물 둘레에 배치합니다.
7. 패턴을 편집하고 원하는 추출 방법에 따라 모양을 수정합니다. 패턴화된 조명 도구의 작업 영역 내에 원하는 패턴이 있는지 확인합니다.
8. 샘플을 PDMS 홀더에 넣고 샘플 위에 정의된 배지를 피펫팅하여 샘플 탈수를 방지하고 방출된 세포에 캐리어 솔루션을 제공합니다.
9. 그런 다음 이것을 보정 미러로 교체하십시오.
10. 현미경 초점을 조정하여 하이드로겔 내 콜로니의 선명한 이미지를 얻습니다. 식민지를 검사하여 관심 있는 식민지를 식별합니다.
11. 여기에서 카메라 보기가 샘플 내부의 콜로니를 표시하는 동안 조명 패턴을 설계하여 세포 추출을 위한 다양한 패턴을 테스트합니다.
12. 정의된 패턴을 저장합니다. 정의된 패턴을 저장한 후 세션 제어 섹션을 선택합니다.
13. 이 섹션의 패턴 조명 도구 제품 이름이 있는 탭 아래에 저장된 시퀀스를 추가합니다.
14. 시퀀스를 추가한 후 패턴을 시뮬레이션하는 옵션을 선택하여 원하는 노출 위치에 맞게 보고 조정합니다.
    참고: 샘플 위치는 패턴이 대상 영역에 정확하게 투영되도록 여기에서 조정할 수 있습니다.
15. 그런 다음 LED 제어 탭에서 광도를 60%로, 노출 시간을 40초로 조정하고 노출 프로세스를 시작합니다.
16. 실시간 및 명시야 모드에서 하이드로겔 분해를 모니터링하여 세포 방출을 보장합니다.
    참고: 빛에 노출되는 동안 샘플의 움직임은 하이드로겔의 원치 않는 영역의 분해를 일으켜 교차 오염을 초래할 수 있으므로 방지하십시오.

9. 세포 검색

1. 365nm 광 노출 및 세포 방출 후 마이크로리터 주사기와 미세유체 튜브를 사용하여 세포를 수집합니다(그림 2).
   참고: 세포 회수는 패턴 노출 직후에 수행해야 합니다. 이를 통해 방출된 세포가 조사된 영역에서 멀어지기 전에 국소적인 세포 회복이 가능합니다.
2. 현미경을 명시야에서 FITC 또는 TRITC 필터로 변경하여 샘플의 노출 영역을 육안으로 시각화할 수 있습니다.
3. 노출된 부위를 찾으면 튜브의 끝을 조사된 지점 위에 놓습니다. 그런 다음 현미경 필터를 다시 명시야로 변경하여 세포 회수를 실시간으로 모니터링합니다.
4. 튜브의 다른 쪽 끝에 부착된 주사기를 사용하여 방출된 세포를 조심스럽게 빼냅니다. 200μL의 용액을 꺼내 DNA 분석 또는 도금을 위해 용액을 1.5mL 원심분리기 튜브에 삽입합니다.

Results

그림 1: 티올화된 유리 커버슬립의 하이드로겔 형성. (A) 두께가 12.7μm인 스페이서를 반응성 티올기를 포함하는 베이스 커버슬립의 반대쪽 두 면에 배치합니다. (B) 하이드로겔 전구체 용액을 비반응성 불소화 유리 슬라이드 위에 피펫팅합니다. (C) 12.7μm 두께의 하이드로겔을 형성하기 위해 비반응성 유리 슬라이드를 스페이서에 배치합니다. (D) 비반응성 유리 슬라이드를 부드럽게 제거하고 하이드로겔을 베이스 커버슬립에 부...

Materials