Uronic Acid Carbazole Assay를 사용한 박테리아 알지네이트의 정량

초록

출처: Al Ahmar, R., et al. 녹농균 의 작은 군집 변종의 배양 및 알지네이트의 정량화. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 산 가수분해 후 우론산을 검출하기 위해 카르바졸을 사용하여 녹 농 균에 의해 생성된 알지네이트를 정량화하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 연구 및 임상 연구에서 박테리아 바이오매스로 정규화된 알지네이트 생산의 비교 분석이 가능합니다.

프로토콜

1. 우론산 카바졸 분석

1. 테스트할 원하는 균주의 순수 배양에서 단일 콜로니를 식별합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 콜로니를 선택하고 이쑤시개를 5mL의 슈도모나스 분리 국물(PIB)이 들어 있는 배양 시험관에 넣습니다. 37°C의 셰이커 인큐베이터에서 24시간 동안 성장시킵니다.
   메모: 다음 균주, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB 및 PAO581pyrD를 PIA(Pseudomonas 분리 한천) 플레이트 또는 0.1 mM 우라실이 보충된 PIA 플레이트에서 성장시켜 측정을 위해 알지네이트를 수확했습니다.
2. 예열된 PIA 플레이트에 배양된 PIB 국물 150μL(15mm x 100mm 플레이트용) 또는 국물 450μL(15mm x 150mm 플레이트용)를 추가합니다. 멸균 세포 스프레더를 사용하여 접시 위에 국물을 펴 바릅니다. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 성장시킵니다.
   메모: 플레이트를 한쪽으로 기울여 피펫을 사용하여 플레이트에서 과도한 액체를 흡입합니다. 프로토콜에 사용된 PIB 및 PIA 플레이트 모두 20mL/L의 글리세롤을 함유하고 있으며, 이는 세포가 알지네이트 생산을 돕기 위해 탄소원으로 사용합니다.
3. 피펫 컨트롤러와 멸균 50mL 피펫을 사용하여 자란 잔디밭에 0.85% NaCl(염화나트륨)을 첨가하고 세포 스프레더를 사용하여 플레이트를 긁어 샘플을 수집합니다. 신선한 50mL 피펫을 사용하여 샘플을 50mL 수집 튜브로 흡인합니다. 샘플을 높은 높이에서 소용돌이치어 혼합하고 얼음 위에 놓습니다.
   메모: 첨가된 0.85% NaCl의 부피는 플레이트의 크기에 따라 다릅니다. 15mm x 100mm 플레이트의 경우 10-30mL를 사용하고 15mm x 150mm 플레이트의 경우 20-50mL를 사용합니다.
4. 일회용 큐벳에 샘플 1mL를 추가하고 분광 광도계를 사용하여 OD를 판독하여 샘플의 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 측정합니다. 이 단계를 2회 반복하여 각 샘플에 대한 판독값을 3번 얻습니다.
5. 3mL의 황산/붕산염 용액을 배양 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 수집된 샘플 350μL를 시험관의 산 혼합물에 천천히 첨가하고 낮게 잠시 소용돌이치십시오.
   1. 물 45mL에 수산화칼륨(KOH) 분말 10.099g을 첨가하여 붕산염 스톡을 준비합니다. 혼합물에 붕산(H₃BO₃) 24.74g을 첨가하고 부피를 100mL로 만듭니다.
   2. 얼음이 담긴 싱크대에 1L 병을 넣고 진한 황산 500mL를 채웁니다. 준비된 붕산염 스톡 15mL를 천천히 첨가합니다. 병을 식히십시오.
   3. 총 25mL에 대해 붕산염 스톡 10mL를 더 추가합니다. 병이 식으면 부피를 1L로 만듭니다.
      주의: 이 방법은 고농축 황산을 사용합니다. 안전을 보장하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 사용해야 하며 샘플에 대한 적절한 폐기 프로토콜을 따라야 합니다.
      메모: 양성 대조군의 경우, 알려진 농도의 D-만누론산 및/또는 알려진 박테리아 알지네이트 샘플을 수확하고 녹농균의 알 지네이트 생산 균주(예: PAO581-PAO1mucA25)를 통해 정제합니다. 음성 대조군의 경우 0.85% NaCl 용액 및/또는 PAO1ΔalgD (박테리아가 알지네이트를 완전히 생성할 수 없게 만드는 algD 유전자의 인프레임 결실)를 사용합니다. 각 샘플에서 여러 개의 튜브를 만들어 통계 분석을 돕기 위해 기술 반복 횟수를 늘릴 수 있습니다. 각 샘플의 3-5 튜브를 준비합니다.
6. 에탄올 용액에 0.1% 카바졸 100μL를 산/시료 혼합물에 첨가합니다. 튜브를 덮고 중간 설정에서 5초 동안 소용돌이치십시오. 55°C의 건욕조에 30분 동안 넣습니다.
7. 배양 후 튜브를 제거하고 높은 온도에서 잠시 소용돌이치고 5분 동안 식힙니다.
   메모: 볼 수 있는 색상은 보라색 음영이 될 것입니다. 색상은 1-2시간 동안 측정을 위해 안정적으로 유지됩니다.
8. 깨끗한 큐벳에 혼합물 1mL를 첨가하고 분광 광도계에서 530nm에서 샘플의 OD를 판독하여 각 튜브의 OD₅₃₀ 을 읽습니다. 0.85% NaCl이 포함된 튜브를 분광 광도계의 블랭크로 사용합니다.
9. 알려진 농도의 D-만누론산(1,024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL 및 8 μg/mL)의 연속 희석액의 OD₅₃₀을 측정하여 표준 곡선을 준비합니다. 2회 반복합니다. 이 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다.
   메모: 표준 곡선은 한 번만 수행하면 됩니다. 여기에서 추출된 선형 방정식은 나중에 테스트에 사용할 수 있습니다.
   1. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 알지네이트 농도를 계산하고 선형 방정식의 알지네이트 농도를 OD₆₀₀ 으로 나누어 OD₆₀₀당 알지네이트의 총량을 얻습니다.

재료