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1. 알지네이트 정량을 위한 ELISA
1. 마이크로피펫을 사용하여 수집된 샘플 50μL를 처리되지 않은 96웰 플레이트에 추가합니다. 50μL의 코팅 완충액(탄산염/중탄산염 완충액 pH 9.6)을 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
메모: 양성 대조군의 경우, 알려진 농도의 D-만누론산 및/또는 알려진 안정한 알지네이트 생산 균주(예: PAO581-PAO1mucA25)를 사용할 수 있습니다. 음성 대조군의 경우 0.85% NaCl 용액 및/또는 PAO1ΔalgD 를 사용합니다( algD 유전자의 프레임 내 결실은 박테리아가 알지네이트를 완전히 생성할 수 없게 만듭니다). 각 샘플에서 여러 웰을 만들어 기술 반복 횟수를 늘려 통계 분석을 지원할 수 있습니다. 각 샘플의 3-5웰을 준비합니다.
2. 분출 병을 사용하여 웰을 채우고 0.05% Tween 20(PBS-T)이 포함된 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트 웰을 2회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 배수합니다.
3. 마이크로피펫을 사용하여 200μL의 차단 완충액(PBS-T의 10% 탈지유)을 웰에 추가합니다. 4°C에서 밤새 배양합니다.
메모: 냉장고에서 증발하지 않도록 접시를 파라핀 필름이나 수축 랩으로 싸십시오.
4. 물총 병을 사용하여 웰을 채워 PBS-T로 플레이트 웰을 2회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 물기를 뺍니다.
5. 마이크로피펫을 사용하여 희석된 1차 항체(마우스 항-알긴산염 단클론 항체) 100μL를 웰에 첨가하고 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
메모: 1차 항체(마우스 항-알긴산염 단클론 항체)를 항체 희석 용액(1x PBS의 1% 탈지유)에 0.5μg/mL(1mg/mL 스톡의 1:2,000 희석)의 농도로 제공하였다.
6. 물총 병을 사용하여 웰을 채워 PBS-T로 플레이트 웰을 3회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 배수합니다.
7. 마이크로피펫을 사용하여 100μL의 희석된 2차 항체를 웰에 첨가하고 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
메모: 사용된 2차 항체는 항체 희석액에서 0.25μg/mL(0.5mg/mL 스톡의 1:2,000 희석)의 농도에 대한 피어스 염소 항마우스 폴리-고추냉이 과산화효소(HRP) 항체였습니다.
8. 물총 병을 사용하여 웰을 채워 플레이트 웰을 PBS-T로 3회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 물기를 뺍니다.
9. 마이크로피펫을 사용하여 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)-ELISA(효소 결합 면역흡착 분석) 용액(재료 표)을 100μL에 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
메모: 긍정적인 반응의 색상은 파란색 음영입니다.
10. 마이크로피펫을 사용하여 100μL의 정지 용액(2N 황산)을 추가합니다.
메모: 정지 용액이 추가되면 색상이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 반응 중단 후 최대 30분 동안 색상이 안정적입니다.
11. 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 OD를 읽습니다.
12. 알려진 농도의 D-만누론산(1,024μg/mL, 512μg/mL, 256μg/mL, 128μg/mL, 64μg/mL, 32μg/mL, 16μg/mL 및 8μg/mL)의 연속 희석액의 OD450을 측정하여 표준 곡선을 생성합니다. 2회 반복합니다. 이 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다.
메모: 표준 곡선은 한 번만 수행하면 됩니다. 여기에서 추출된 선형 방정식은 나중에 테스트에 사용할 수 있습니다.
1. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 알지네이트 농도를 계산하고 선형 방정식의 알지네이트 농도를 OD600 으로 나누어 OD600당 알지네이트의 총량을 구합니다.