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방법 논문
455 조회수
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2025년 9월 26일
출처: Al Ahmar, R., et al. 녹농균 의 작은 군집 변종의 배양 및 알지네이트의 정량화. J. Vis. 경험. (2020년)
이 비디오는 녹농균에 의해 생성되는 보호용 엑소다당류인 알긴산염을 정량화하기 위한 비색 면역분석법을 보여줍니다. 이 절차에는 마이크로플레이트를 샘플로 코팅하고, 특정 항체를 적용하고, 효소-기질 반응을 사용하여 측정 가능한 색상 변화를 생성하는 작업이 포함됩니다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 샘플의 색상 강도에 따라 알지네이트 농도를 결정합니다.
1. 알지네이트 정량을 위한 ELISA
1. 마이크로피펫을 사용하여 수집된 샘플 50μL를 처리되지 않은 96웰 플레이트에 추가합니다. 50μL의 코팅 완충액(탄산염/중탄산염 완충액 pH 9.6)을 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
메모: 양성 대조군의 경우, 알려진 농도의 D-만누론산 및/또는 알려진 안정한 알지네이트 생산 균주(예: PAO581-PAO1mucA25)를 사용할 수 있습니다. 음성 대조군의 경우 0.85% NaCl 용액 및/또는 PAO1ΔalgD 를 사용합니다( algD 유전자의 프레임 내 결실은 박테리아가 알지네이트를 완전히 생성할 수 없게 만듭니다). 각 샘플에서 여러 웰을 만들어 기술 반복 횟수를 늘려 통계 분석을 지원할 수 있습니다. 각 샘플의 3-5웰을 준비합니다.
2. 분출 병을 사용하여 웰을 채우고 0.05% Tween 20(PBS-T)이 포함된 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트 웰을 2회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 배수합니다.
3. 마이크로피펫을 사용하여 200μL의 차단 완충액(PBS-T의 10% 탈지유)을 웰에 추가합니다. 4°C에서 밤새 배양합니다.
메모: 냉장고에서 증발하지 않도록 접시를 파라핀 필름이나 수축 랩으로 싸십시오.
4. 물총 병을 사용하여 웰을 채워 PBS-T로 플레이트 웰을 2회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 물기를 뺍니다.
5. 마이크로피펫을 사용하여 희석된 1차 항체(마우스 항-알긴산염 단클론 항체) 100μL를 웰에 첨가하고 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
메모: 1차 항체(마우스 항-알긴산염 단클론 항체)를 항체 희석 용액(1x PBS의 1% 탈지유)에 0.5μg/mL(1mg/mL 스톡의 1:2,000 희석)의 농도로 제공하였다.
6. 물총 병을 사용하여 웰을 채워 PBS-T로 플레이트 웰을 3회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 배수합니다.
7. 마이크로피펫을 사용하여 100μL의 희석된 2차 항체를 웰에 첨가하고 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
메모: 사용된 2차 항체는 항체 희석액에서 0.25μg/mL(0.5mg/mL 스톡의 1:2,000 희석)의 농도에 대한 피어스 염소 항마우스 폴리-고추냉이 과산화효소(HRP) 항체였습니다.
8. 물총 병을 사용하여 웰을 채워 플레이트 웰을 PBS-T로 3회 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 물기를 뺍니다.
9. 마이크로피펫을 사용하여 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)-ELISA(효소 결합 면역흡착 분석) 용액(재료 표)을 100μL에 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
메모: 긍정적인 반응의 색상은 파란색 음영입니다.
10. 마이크로피펫을 사용하여 100μL의 정지 용액(2N 황산)을 추가합니다.
메모: 정지 용액이 추가되면 색상이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 반응 중단 후 최대 30분 동안 색상이 안정적입니다.
11. 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 OD를 읽습니다.
12. 알려진 농도의 D-만누론산(1,024μg/mL, 512μg/mL, 256μg/mL, 128μg/mL, 64μg/mL, 32μg/mL, 16μg/mL 및 8μg/mL)의 연속 희석액의 OD450을 측정하여 표준 곡선을 생성합니다. 2회 반복합니다. 이 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다.
메모: 표준 곡선은 한 번만 수행하면 됩니다. 여기에서 추출된 선형 방정식은 나중에 테스트에 사용할 수 있습니다.
1. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 알지네이트 농도를 계산하고 선형 방정식의 알지네이트 농도를 OD600 으로 나누어 OD600당 알지네이트의 총량을 구합니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1-Step 울트라 TMB-ELISA | 써모 사이언티픽 | 34028 | 피셔 사이언티픽을 통해 |
| 분석 플레이트 96-well | 코스타 | 2021-12-20 | |
| 탄산염-중탄산염 완충액 | 시그마 | C3041 | |
| 원심분리기 튜브(50mL) | 피셔 사이언티픽 | 05-539-13 | 피셔 사이언티픽을 통해 |
| 배양 시험관 | 피셔 사이언티픽 | 14-956-6D | 피셔 사이언티픽을 통해 |
| 큐벳 폴리스티렌(1.5mL) | 피셔 사이언티픽 | 14955127 | 피셔 사이언티픽을 통해 |
| D-만누론산 나트륨 | 시그마 알드리치 | SMB00280 | |
| FMC 알지네이트 | FMC | 2133 | |
| 마우스 항알지네이트 단클론 항체 | QED 바이오사이언스 | 해당 사항 없음 | 로트 # : 15725/15726 |
| 인산염 완충 식염수 분말(PBS) | 시그마 | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP 항체 | 써모 사이언티픽 | 32230 | 피셔 사이언티픽을 통해 |
| 둥근 이쑤시개 | 다이아몬드 | 모든 브랜드 | |
| 해조류 알지네이트(Protanal CR 8133) | FMC 코퍼레이션 | ||
| 탈지유 | 디프코 | 232100 | 피셔 사이언티픽을 통해 |
| SmartSpec Plus 분광 광도계 | 바이오래드 | 170-2525 | 또는 선호하는 공급업체 |
| 염화나트륨(NaCl) | 시그마 | S-5886 | |
| SpectraMax i3x 다중 모드 마이크로플레이트 리더 | 분자 장치 | i3x | 또는 선호하는 공급업체 |
| 황산(2 일반 정지 용액) | R&D 시스템 | 디994 | |
| 트윈 20 | 시그마 | P2287 |
