동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
- 접종물의 준비
메모: 이 섹션에는 혐기성 성장 스트렙토마이신 내성 Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR에서 접종을 준비하기 위한 일반적인 단계가 포함되어 있습니다. 이 섹션의 모든 단계는 혐기성 챔버에서 수행되어야 합니다.
- 준비된 뉴욕시 국물 III(NYCIII), 한천 및 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한 모든 시약을 혐기성 챔버로 순환시켜 사용하기 전에 최소 24시간 동안 평형을 유지합니다.
메모: 여기에서는 5% 수소 가스 혼합물로 평형을 이룬 비닐 혐기성 챔버를 사용했습니다. 내부 산소 농도는 일반적으로 0ppm이지만 재료를 챔버로 순환시킬 때 낮은 수준의 일시적 증가(10-25ppm)가 있을 수 있습니다. - 질 접종 2일 전, 냉동 글리세롤 스톡에서 혐기성 챔버의 NYC III 한천 플레이트에 Gardnerella 를 줄무늬로 제거합니다. 드라이아이스로 채워진 작은 용기(예: 빈 피펫 팁 상자)를 사용하여 챔버 안팎으로 운반하는 동안 글리세롤 스톡을 얼린 상태로 유지하십시오.
- 질 접종 1일 전에 플레이트에서 5-10개의 개별 Gardnerella 콜로니를 사용하여 NYC III 국물 10mL를 접종합니다. 액체 배양액을 37°C에서 16시간 동안 밤새 성장시킵니다. 접종되지 않은 채로 남아 있는 배양 배지의 두 번째 1mL 분취량을 포함하고 접종된 배양액과 함께 배양하여 배지가 오염되지 않았는지 확인합니다.
- 아래에 설명된 대로 액체 배양에서 접종물을 준비합니다. 가능한 한 혐기성 챔버에서 접종 준비를 수행하십시오.
- 1.5mL 큐벳(1:5 희석)에서 800μL의 신선한 배지에 200μL의 배양액을 첨가하여 배양 광학 밀도(OD)를 결정합니다. 분광 광도계를 사용하여 600nm의 파장에서 희석된 배양물의 밀도(OD)를 측정합니다(블랭크로 신선한 배지만 있는 별도의 큐벳 사용). OD 판독값에 5를 곱하여 16시간 배양의 실제 OD600 을 얻습니다.
- 실험에 필요한 접종물의 부피를 계산합니다. 예를 들어, 마우스당 20μL의 접종물로 15마리의 마우스를 감염시키려면 15 x 20μL = 300μL의 접종물이 필요합니다. 필요한 것보다 약 25% 더 많은 접종물을 준비하므로 15마리의 마우스에 대해 300μL + (0.25 x 300μL) = 375μL의 접종물을 준비합니다.
- 단계 1.4.1에서 결정된 OD600 을 사용하여, 단계 1.4.2에서 계산된 부피에서 OD600 = 5.0 접종물을 얻기 위해 스핀다운하고 재현탁해야 하는 16시간 배양의 부피를 계산한다. 예를 들어, 배양액의 OD600 이 1.5이고 필요한 접종량이 375μL인 경우 스핀다운할 배양액의 부피는 (375μL x 5)/1.5 = 1250μL입니다.
- 1.4.3단계에서 계산된 배양량을 피펫팅합니다. 멸균 미세 원심분리기 튜브로. 16,000 x g 에서 1-3분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다.
- 상청액을 제거하고 1.4.2단계에서 계산된 부피로 혐기성 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 접종물은 이제 계산된 OD600 5.0이 됩니다. 해당되는 경우, 감염되지 않은 대조군의 마우스에 대한 비히클 대조군 역할을 할 PBS 튜브도 준비합니다.
- 혐기성 챔버에서 접종 튜브를 제거하기 전에 PBS에서 1:10에서 1:10 x 106 까지 연속 희석 시리즈를 준비합니다. 스폿 플레이트 5는 접종물의 콜로니 형성 단위 또는 CFU를 결정하기 위해 다중 채널 피펫을 사용하여 한천 플레이트에 각 희석액을 복제합니다. 이것은 접종 전 CFU입니다.
- 질 세척 전 및 Gardnerella 접종
- 혐기성 챔버에 질 세척/세척 튜브를 준비합니다. 70μL의 멸균 혐기성 PBS를 마우스 번호로 표지된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 마우스당 하나의 세척 튜브를 준비합니다. 튜브를 단단히 닫고 혐기성 챔버에서 순환합니다.
- 2.1단계에서 준비된 개별 튜브에서 50μL 혐기성 PBS로 각 마우스에 질 세척을 수행합니다. 이러한 질 세척은 접종 전 세척제이며 다운스트림 측정 및 분석에 사용할 수 있습니다.
- 두 번째 β-에스트라디올 발레레이트 주사를 투여한 후, 각 마우스를 케이지 또는 앞발로 잡을 수 있는 깨끗하고 단단한 표면 위에 놓습니다. 꼬리의 중간 부분을 부드럽게 잡고 뒷다리가 약간 올라가고 질 입구가 노출되도록 들어 올립니다.
- 피펫과 p-200 필터 팁을 사용하여 적절한 마우스에 해당하는 세척 튜브에서 50μL의 PBS를 끌어냅니다. 피펫 팁을 질 내강 ~2-3mm에 부드럽게 삽입하고 50μL 부피를 3x-4x로 부드럽게 안팎으로 피펫팅합니다.
- 수집된 세척 물질(~50μL)을 원래 있던 동일한 세척 튜브로 다시 옮기고, 나머지 20μL의 PBS가 여전히 들어 있는 세척 튜브에서 위아래로 피펫팅합니다. 점액이 너무 많아 팁이 막히면 깨끗한 p200 팁을 사용하여 남은 물질을 모아 동일한 세척 튜브에 넣으십시오.
- 농축된 박테리아 현탁액 또는 비히클 대조군 20μL를 각 마우스의 질에 질내로 투여합니다. 해당 마우스에 대한 질 세척 직후 각 마우스를 접종합니다(즉, 다음 마우스로 이동하기 전에 각 마우스에 대해 순차적으로 세척 및 접종을 수행합니다). 이 과정을 단순화하려면 두 개의 p200 피펫을 사용하며, 하나는 세척을 위해 50 μL로 설정하고 다른 하나는 접종을 위해 20 μL로 설정합니다.
- 2.2.1단계에 설명된 대로 마우스를 고정합니다. p-200 팁을 사용하여 20μL의 박테리아 현탁액을 질에 피펫팅합니다. 두 가지 다른 박테리아 종/균주를 사용한 공동 접종 실험의 경우 각 박테리아 현탁액 10μL를 사용하고 접종 전에 두 균주를 혼합하지 마십시오.
메모: 총 접종량은 질 밖으로 유출되는 것을 방지하기 위해 20μL를 초과해서는 안 됩니다. - 투여된 부피가 질 입구에서 즉시 고이는 것을 방지하기 위해 각 마우스의 뒷쪽 끝을 10-20초 동안 계속 유지합니다. 그런 다음 마우스를 새 케이지/용기에 넣거나 이미 접종된 케이지 메이트와 함께 넣습니다.
- 2.2단계를 반복합니다. 및 2.3단계. 각 마우스에 대해. 아직 접종하지 않은 동물과 함께 쥐를 케이지에 다시 넣지 마십시오. 이는 접종 전에 스트렙토마이신 내성 박테리아에 마우스가 부주의하게 노출되는 것을 방지합니다.
- 모든 마우스를 접종한 후 접종 튜브를 혐기성 챔버로 다시 순환시킵니다. 1.5단계에 설명된 대로 다른 연속 희석액을 준비하고 도금합니다. 이것은 접종 후 CFU입니다. 접종 후 플레이트와 접종 전 플레이트의 CFU를 비교하여 동물을 접종하는 동안 혐기성 챔버 외부에 있는 동안 접종물의 생존력이 감소했는지 확인합니다.
- 2.2단계에서 수집한 질 세척액을 플레이트합니다. 선택적 한천(이 경우 1mg/mL 스트렙토마이신). 플레이트를 37°C의 혐기성 챔버에서 1-2일 동안 배양하고 성장을 검사합니다. 참고: 성장은 마이크로바이옴의 내인성 구성원이 선택 마커에 내성이 있으므로 표적 유기체의 CFU 열거를 모호하게 할 수 있음을 나타냅니다.
- 생존 가능한 가드네렐라 집락화를 결정하기 위한 질 세척제 수집
- 질 집락화를 분석하기 위해 선택한 시점에서 질 세척액을 수집합니다. 2.2단계에 설명된 대로 수집합니다.
- 수집 직후 질 세척액을 혐기성 챔버로 순환시킵니다. 각 세척액 10μL를 사용하여 1.5단계에서 설명한 대로 선택적 한천에 연속 희석 및 도금을 수행합니다. CFU 수를 Gardnerella (또는 관심 있는 다른 혐기성 균)에 의한 질 집락화의 척도로 사용하십시오.
