미세 주입을 사용하여 제브라피쉬 유충의 장 내강으로 박테리아의 국소 전달

초록

출처: Li, J. et al. Clostridioides difficile에 대한 유충 제브라피쉬 감염 모델 개발. J. Vis. 경험. (2020년)

이 비디오는 형광 표지된 Clostridioides difficile 을 마취된 제브라피쉬 유충의 장 내강으로 미세 주입 기반 전달을 보여줍니다. 유충 준비, 박테리아 주입 및 형광 현미경 기반 장 내 박테리아 국소화 확인과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 염색된 클로스트리디오이데스 디피실을 제브라피쉬 유충에 주입

1. 수정 후 5일(여기서는 5dpf라고 함)에 0.02%–0.04% 트리카인(트리카인 분말을 이중 증류수에 용해시키고 1M Tris-HCL 용액으로 pH = 7로 조정됨)으로 20-30마리의 제브라피쉬 유충을 주입 전 ~10분 전에 마취합니다. 마취된 유충을 신선한 10cm 페트리 접시로 옮기고 초과 30% Danieau's 배지를 제거합니다.
2. 0.8% 저융점 아가로스를 제브라피쉬 유충 위에 떨어뜨려 덮습니다. 유충을 측면 위치로 부드럽게 조정하십시오. 페트리 접시를 얼음 위에 30-60초 동안 놓아 저융점 아가로스가 응고되도록 합니다. 아가로스를 덮기 위해 0.02%–0.04% 트리카인을 함유한 30% Danieau 배지를 첨가합니다.
3. 주사 용액을 준비합니다. 인산염 완충 식염수(PBS) 용액에 0.5% 페놀 레드 1μL를 염료 염색된 클로스트리디오이데스 디피실 접종물 9μL에 첨가하여 주입 과정을 시각화합니다.
4. 마이크로로더를 사용하여 보정된 마이크로주입 바늘에 주입 용액을 로드합니다. 로드된 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 실체 현미경 아래에 배치합니다.
5. 사출 압력을 600–900hPa 사이로 조정합니다. 주입 시간을 0.1–0.3초로 설정하여 0.5–1.0 nL을 얻습니다. 마이크로 매니퓰레이터의 바늘을 내장된 유충을 가리키는 ~45° 각도로 설정합니다.
6. 바늘 끝을 위장관 위, 비뇨생식기 모공에 가깝게 놓습니다. 아가로스를 관통한 다음 바늘 끝으로 근육을 뚫은 다음 장 내강에 삽입하고 0.5-1.0nL의 클로스트리디오이데스 디피실을 주입합니다. 형광 현미경을 사용하여 주입된 유충을 모니터링하고 공초점 이미징을 위해 적절하게 주입된 유충을 픽업합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스 저융점 (LM)	프로나디사	8050	아가로스 플레이트에 사용됩니다.
BacLight 레드 박테리아 스테인	써모 피셔 사이언티픽	B35001	형광 염료
모세관 유리	하버드 장치	30-0019	주사 바늘
클로스트리디오이데스 디피실			R20291, 리보타입 027 균주, TcdA+/TcdB+/CDT+ 생산
DMSO	칼 로스 GmbH	A994
피지	오픈 소스 플랫폼		이미지 처리
마이크로 인젝터	에펜도르프	5253000017
라이카 SP8 공초점 현미경	라이카
페놀 레드	시그마-알드리치	P0290
트리카인	시그마-알드리치	E10521