마이크로어레이 스크리닝을 통한 박테리아 퇴치성 폴리머의 고처리량 식별

초록

출처: Venkateswaran, S., et al. 의료 기기용 박테리아 퇴치제 폴리머의 고처리량 식별. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 혼합 박테리아 배양에 노출된 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 박테리아 퇴치성 폴리머를 식별하는 고처리량 방법을 보여줍니다. 박테리아 결합은 DAPI 형광에 의해 평가되며, 여기서 감소된 신호는 표면 부착이 최소화된 폴리머를 나타냅니다.

프로토콜

1. 고분자 마이크로어레이에 박테리아를 접종

메모: 우수한 무균 기술을 확인하십시오. 배양의 모든 취급은 분젠 버너 또는 플로우 후드를 사용하여 멸균 환경에서 수행되어야 합니다. 배양은 산소 가용성, 성장 배지 및 온도를 각 종의 요구 사항에 맞게 조정하여 재배해야 합니다.

1. 5mL Luria-Bertani 국물(LB: 10g/L 박토트립톤, 5g/L 염화나트륨, NaCl 및 10g/L 효모 추출물)을 플레이트의 콜로니와 접종하여 하룻밤 배양을 준비합니다. 37°C에서 밤새 배양하고 200rpm(분당 회전수)에서 흔듭니다.
2. 글리세롤(전체 농도 10%)을 첨가하여 하룻밤 배양의 냉동 스톡을 준비하고 스톡을 -80°C에서 보관합니다.
3. 해동된 박테리아 스톡의 샘플에서 세포 수를 결정하기 위해 각 스톡의 연속 희석을 수행하고 고체 배지에서 밤새 박테리아를 성장시킵니다. 재고의 세포 수를 정확하게 측정하면 각 종의 적절한 접종이 보장됩니다.
4. 마이크로어레이용 접종을 준비합니다. 단일 종 배양은 위와 같이 성장하고 마이크로어레이에 직접 적용됩니다. BacMix-1은 폐렴균(K. pneumoniae), 부생포도상구균(S. saprophyticus) 및 황색포도상구균(S. aureus)의 박테리아 혼합물입니다. BacMix-2는 Streptococcus mutans(S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae 및 Enterococcus faecalis(E. faecalis)로 구성된 박테리아 혼합물입니다.
5. 혼합 배양액을 생산하려면 같은 양(각각 3ml)으로 하룻밤 동안 혼합하고 신선한 LB로 4배 희석합니다(최종 부피 약 50ml까지).
6. 자외선 멸균된 폴리머 마이크로어레이를 직사각형 4웰 플레이트에 넣고 37°C에서 6ml의 혼합 박테리아 배양과 함께 5일 동안 부드럽게 교반(30rpm)합니다.
7. 배양 후, 인산염 완충 식염수(PBS: 137mM NaCl, 2.7mM 염화칼륨, KCl, 10mM 인산수소이나트륨, Na₂HPO₄, 1.8mM 인산이수소칼륨, KH₂PO₄)로 마이크로어레이를 부드럽게 두 번 헹구고 PBS에서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색액 1μg/ml 용액과 함께 30분 동안 배양합니다.
8. 염색된 마이크로어레이 슬라이드를 PBS로 덮고 부드럽게 소용돌이치며 PBS를 한 번 교체하여 신선한 웰 플레이트에서 세척합니다. 공기의 흐름으로 건조하십시오. 마이크로어레이 슬라이드에 유리 덮개 슬립을 바르고 접착제로 제자리에 밀봉합니다. 건조되면 외부 표면을 70%(v/v) 에탄올로 멸균합니다.
9. 봉쇄 수준에 따라 배양균을 안전하게 폐기하십시오.

2. 마이크로어레이 이미징 및 분석

1. 명시야 및 DAPI(여기/방출, Ex/Em = 358 nm / 361 nm) 채널에서 각 폴리머 스폿에 대한 단일 이미지를 캡처합니다. 형광 현미경을 사용하거나 20X 대물렌즈가 장착된 자동 형광 현미경(이미지 획득 소프트웨어로 제어되는 X-Y-Z 스테이지 포함)을 사용하여 이 작업을 수동으로 수행합니다.
   메모: 현미경을 조정하여 명시야 및 DAPI 채널을 사용하여 이미지를 얻습니다. 모든 마이크로어레이에 대한 이미지 캡처를 위한 게인 및 노출 시간이 동일한지 확인합니다.
2. 스폿 영역을 선택하고 이미지 처리 소프트웨어로 형광을 정량화하여 DAPI 채널에서 각 스폿의 평균 형광 강도를 얻습니다.
3. 각 스폿의 배경 형광을 위해, 박테리아가 없는 배지로만 배양된 복제 마이크로어레이에서 폴리머 스폿의 이미지를 얻습니다. 박테리아로부터 형광을 얻기 위해 스폿의 강도에서 배경 형광을 뺍니다.
4. 다양한 폴리머의 박테리아 결합을 비교하는 데 사용되는 각 폴리머를 나타내는 4개의 지점에서 평균 정규화된 값을 계산합니다.
5. 박테리아 결합이 가장 적은(형광이 가장 낮음) 폴리머를 '히트' 폴리머로 식별합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실란 준비 슬라이드	시그마	에스4651
고분자	사내에서 합성	해당 없음
LB 국물	옥소이드	CM1018
DAPI	써모 피셔	D1306
(3-아미노프로필) 트리에톡시실란 코팅 유리 슬라이드	시그마	실란 준비
설비
마이크로어레이 현미경	임스타	선구자
공초점 현미경	라이카	SP5
이미지 분석 소프트웨어	미디어 사이버네틱스	이미지-프로 플러스