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1. 고분자 마이크로어레이에 박테리아를 접종
메모: 우수한 무균 기술을 확인하십시오. 배양의 모든 취급은 분젠 버너 또는 플로우 후드를 사용하여 멸균 환경에서 수행되어야 합니다. 배양은 산소 가용성, 성장 배지 및 온도를 각 종의 요구 사항에 맞게 조정하여 재배해야 합니다.
- 5mL Luria-Bertani 국물(LB: 10g/L 박토트립톤, 5g/L 염화나트륨, NaCl 및 10g/L 효모 추출물)을 플레이트의 콜로니와 접종하여 하룻밤 배양을 준비합니다. 37°C에서 밤새 배양하고 200rpm(분당 회전수)에서 흔듭니다.
- 글리세롤(전체 농도 10%)을 첨가하여 하룻밤 배양의 냉동 스톡을 준비하고 스톡을 -80°C에서 보관합니다.
- 해동된 박테리아 스톡의 샘플에서 세포 수를 결정하기 위해 각 스톡의 연속 희석을 수행하고 고체 배지에서 밤새 박테리아를 성장시킵니다. 재고의 세포 수를 정확하게 측정하면 각 종의 적절한 접종이 보장됩니다.
- 마이크로어레이용 접종을 준비합니다. 단일 종 배양은 위와 같이 성장하고 마이크로어레이에 직접 적용됩니다. BacMix-1은 폐렴균(K. pneumoniae), 부생포도상구균(S. saprophyticus) 및 황색포도상구균(S. aureus)의 박테리아 혼합물입니다. BacMix-2는 Streptococcus mutans(S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae 및 Enterococcus faecalis(E. faecalis)로 구성된 박테리아 혼합물입니다.
- 혼합 배양액을 생산하려면 같은 양(각각 3ml)으로 하룻밤 동안 혼합하고 신선한 LB로 4배 희석합니다(최종 부피 약 50ml까지).
- 자외선 멸균된 폴리머 마이크로어레이를 직사각형 4웰 플레이트에 넣고 37°C에서 6ml의 혼합 박테리아 배양과 함께 5일 동안 부드럽게 교반(30rpm)합니다.
- 배양 후, 인산염 완충 식염수(PBS: 137mM NaCl, 2.7mM 염화칼륨, KCl, 10mM 인산수소이나트륨, Na2HPO4, 1.8mM 인산이수소칼륨, KH2PO4)로 마이크로어레이를 부드럽게 두 번 헹구고 PBS에서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색액 1μg/ml 용액과 함께 30분 동안 배양합니다.
- 염색된 마이크로어레이 슬라이드를 PBS로 덮고 부드럽게 소용돌이치며 PBS를 한 번 교체하여 신선한 웰 플레이트에서 세척합니다. 공기의 흐름으로 건조하십시오. 마이크로어레이 슬라이드에 유리 덮개 슬립을 바르고 접착제로 제자리에 밀봉합니다. 건조되면 외부 표면을 70%(v/v) 에탄올로 멸균합니다.
- 봉쇄 수준에 따라 배양균을 안전하게 폐기하십시오.
2. 마이크로어레이 이미징 및 분석
- 명시야 및 DAPI(여기/방출, Ex/Em = 358 nm / 361 nm) 채널에서 각 폴리머 스폿에 대한 단일 이미지를 캡처합니다. 형광 현미경을 사용하거나 20X 대물렌즈가 장착된 자동 형광 현미경(이미지 획득 소프트웨어로 제어되는 X-Y-Z 스테이지 포함)을 사용하여 이 작업을 수동으로 수행합니다.
메모: 현미경을 조정하여 명시야 및 DAPI 채널을 사용하여 이미지를 얻습니다. 모든 마이크로어레이에 대한 이미지 캡처를 위한 게인 및 노출 시간이 동일한지 확인합니다. - 스폿 영역을 선택하고 이미지 처리 소프트웨어로 형광을 정량화하여 DAPI 채널에서 각 스폿의 평균 형광 강도를 얻습니다.
- 각 스폿의 배경 형광을 위해, 박테리아가 없는 배지로만 배양된 복제 마이크로어레이에서 폴리머 스폿의 이미지를 얻습니다. 박테리아로부터 형광을 얻기 위해 스폿의 강도에서 배경 형광을 뺍니다.
- 다양한 폴리머의 박테리아 결합을 비교하는 데 사용되는 각 폴리머를 나타내는 4개의 지점에서 평균 정규화된 값을 계산합니다.
- 박테리아 결합이 가장 적은(형광이 가장 낮음) 폴리머를 '히트' 폴리머로 식별합니다.