분자 분석을 위한 물 샘플에서 항생제 내성 박테리아 분리

초록

출처: Ghadigaonkar, D. 및 Rath, A. 수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별 및 항생제 내성 유전자의 분자 특성화. J. Vis. 경험. (2023년)

이 비디오는 선택적 배지를 사용하여 물 샘플에서 항생제 내성 박테리아를 분리하고 준비하는 방법을 보여줍니다. DNA는 항생제 내성 박테리아에서 추출되고 증폭되어 박테리아 항생제 내성 유전자를 식별합니다.

프로토콜

1. 샘플 수집 및 처리

1. 샘플 수집
   1. 멸균 샘플 용기에 적절한 양의 물 샘플을 수집하여 용기의 3/4 이상이 채워지지 않도록 합니다.
   2. 샘플은 수집 후 가능한 한 빨리 무균 상태에서 실험실로 운반하고 즉시 처리하십시오.
2. 샘플 처리
   1. 미립자 물질을 제거하기 위해 멸균 모슬린 천을 통해 물 샘플을 무균 여과합니다.
   2. 추가 분석을 위해 여과된 물의 적절한 연속 희석을 수행합니다.

2. 총 박테리아 부하 및 항생제 내성 박테리아 수 추정

1. 총 박테리아 부하 결정
   1. Reasoner의 2A 한천(R2A 한천) 변성 분말 18.12g을 이중 증류수 1,000mL에 현탁하고 가열하여 혼합물을 녹입니다. 용해된 혼합물을 121°C, 제곱인치당 15파운드(psi)에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 적절한 양의 고압멸균 혼합물을 멸균 페트리 플레이트에 부어 R2A 한천 변형 플레이트를 준비합니다(예: 약 20mL의 고압멸균 멸균 배지를 90mm 멸균 페트리 플레이트에 추가).
   2. 배지가 응고되면 여과된 물 샘플의 적절한 희석액 100μL를 R2A 한천, 변형 플레이트에 고르게 펴 바릅니다. 실험을 중복으로 수행합니다.
   3. 위의 모든 플레이트를 35 - 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다(분리에 사용되는 배지에 따라 온도 및 배양 시간을 변경하십시오).
   4. 방정식 (1)을 사용하여 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)로 총 박테리아 부하를 표현합니다.
2. AR 박테리아 수 측정
   1. 2.1.1-2.1.4단계를 따릅니다. 그러나 R2A 한천, 변형 플레이트 대신, 5가지 항생제, 즉 세포탁심(3μg/mL), 시프로플록사신(0.5μg/mL), 에리스로마이신(20μg/mL), 카나마이신(15μg/mL) 및 반코마이신(3μg/mL).
   2. 2.2.1단계에서 언급한 최종 항생제 농도를 달성하기 위해 변성된(용융된 R2A 한천의 온도로, ≤40°C에서 변성된) 멸균 용융 R2A 한천 20mL가 들어 있는 튜브에 항생제를 별도로 첨가합니다.
   3. 고르게 혼합되도록 소용돌이치고 한천이 응고되기 전에 멸균 페트리 플레이트에 붓습니다. 실험을 중복으로 수행합니다.
   4. 위의 모든 플레이트를 35 - 37°C에서 48시간 동안 배양합니다(다른 배지를 사용하는 경우 온도 및 배양 시간이 다를 수 있음).
   5. 항생제의 품질 관리 및 효능 확인을 위해 대 장균 ATCC 25922 및 황색포도상구균 ATCC 29213 균주의 박테리아 현탁액 100μL를 각각의 항생제 함유 R2A 한천, 변형된 플레이트에 퍼뜨립니다(접종에 사용되는 신선한 배양물의 밀도가 광학 밀도, OD = 0.5 at 600nm인지 확인).
   6. 2.1.4단계에 설명된 대로 CFU/mL 기준으로 항생제 내성 박테리아 수를 결정합니다.

3. 16S 리보솜 RNA(rRNA) 유전자 염기서열 분석에 의한 배양 가능한 박테리아의 동정

1. 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 분리주로부터 DNA 주형의 제조
   1. 멸균 이쑤시개를 사용하여 페트리 플레이트에서 자라는 분리물의 단일하고 분리된 순수한 콜로니를 채취합니다. 박테리아 콜로니를 멸균 미세 원심분리기 튜브의 멸균 이중 증류수 100μL에 현탁시키고 10분 동안 끓입니다.
   2. 현탁액을 10,000 × g 에서 2분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿화하고 상청액을 조 DNA 주형으로 사용하기 위해 신선한 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
2. 16S rRNA 유전자의 V3 영역의 표적 PCR 증폭 및 시퀀싱
   1. 표 1에 언급된 대로 PCR 증폭을 위해 PCR 튜브에 반응 혼합물 40μL를 준비합니다.
      메모: DNA 준비는 오염 가능성을 최소화하면서 얼음 블록 위에서 수행해야 합니다(시약을 취급하는 동안 장갑을 착용하고 작업 표면을 70% 에탄올로 철저히 청소하십시오).
   2. 튜브를 열 블록에 놓고 PCR 열 순환기에서 적절한 프로그램을 실행합니다. 표준화된 PCR 순환 조건 및 16S rRNA 유전자의 V3 영역 증폭에 대한 프라이머 정보는 표 2 를 참조하십시오.

표 1: PCR 마스터믹스 성분. 다양한 PCR 시약의 반응 혼합물 조성물.

PCR 시약	부피(μL)
2x Taq 마스터 믹스	20
포워드 프라이머(10피코몰)	1.5
리버스 프라이머(10피코몰)	1.5
조잡한 DNA 주형	1.5
멸균 분자 생물학 물	15.5
총 볼륨	40

 

 

 

 

 

 

 

표 2: 16S rRNA 유전자의 증폭을 위한 PCR 주기 조건. 16S rRNA 유전자 증폭에 필요한 PCR 사이클 조건이 나와 있습니다. 이 단계에는 초기 변성 단계, 35 사이클의 변성, 어닐링 및 확장 및 최종 확장 단계가 포함됩니다.

방향	프라이머 시퀀스 5' – 3'	PCR 조건	아니요. 사이클 수
전달	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94°C에서 10분 동안	1
		94°C에서 30초 동안 변성	35
		50°C에서 30초 동안 어닐링
		72°C에서 40초 동안 확장
후진	CTACCGGGGTATCTAATCC	72°C에서 5분 동안 최종 확장	1

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2x PCR Taq 마스터믹스	하이미디어	MBT061-50R	PCR 반응 혼합물 제조용
37 °C 인큐베이터	GS-192, 가야트리 사이언티픽	NA	박테리아 배양용
오토 클레이 브	에퀴트론	NA	매체, 유리판, 시험관 등의 멸균에 필요
Bisafety B2 캐비닛	IMSET	IMSET BSC-클래스 II 유형 B2	박테리아 배양, AST 등과 같은 미생물 작업에 사용됩니다.
세포탁심 항생제 분말	하이미디어	TC352-5G	항생제 내성균 분리 시 필요한 항생제 원액 제조용
원심분리기 미니스핀	에펜도르프	미니스핀 플러스-5453	조잡한 DNA 준비 중에 파편을 펠릿화하는 데 사용됩니다.
시프로플록사신 항생제 분말	하이미디어	TC447-5G	항생제 내성균 분리 시 필요한 항생제 원액 제조용
색도계	퀘스트	NA	배양 현탁액의 OD 확인용
냉각 셰이커 인큐베이터	BTL41 얼라이드 사이언티픽	NA	박테리아 배양을 위한 배지 플레이트 인큐베이션용
에리스로마이신 항생제 분말	하이미디어	CMS528-1G	항생제 내성균 분리 시 필요한 항생제 원액 제조용
에리스로마이신 항생제 분말	하이미디어	TC024-5G	항생제 내성균 분리 시 필요한 항생제 원액 제조용
카나마이신 항생제 분말	하이미디어	MB105-5G	항생제 내성균 분리 시 필요한 항생제 원액 제조용
루리아 베르타니 국물	히미디어	M1245-500G	문화의 풍요로움을 위해
R2A 한천, 변형	하이미디어	M1743	총 및 항생제 내성(AR) 박테리아 부하를 분리하기 위한 배지 플레이트 준비용
소금	하이미디어	TC046-500G	물 샘플을 연속적으로 희석하기 위한 0.85% 식염수 준비용
황색포도상구균 아종 황색포도상구균 ATCC 29213	하이미디어	0365P	AST를 수행하는 동안 컨트롤로 사용
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