식물 숙주와 상호 작용하는 박테리아의 분자 반응을 연구하기 위한 공동 배양 시스템

초록

출처: Nathoo, N., et al. 식물/미생물 분자 상호 작용 및 신호 전달의 동시 및 체계적 분석을 위한 수경 공동 재배 시스템. J. Vis. 경험. (2017).

이 비디오는 멸균 조건에서 식물-박테리아 상호 작용을 연구하기 위한 수경 공동 재배 시스템을 보여줍니다. 식물 묘목은 멸균된 산성 성장 배지로 옮겨져 배양되고 Agrobacterium을 접종하기 전에 오염 여부를 검사합니다. 활성화된 박테리아는 식물 뿌리에 부착되어 T-DNA를 식물 세포로 전달하며 박테리아 집락화를 강화하는 분자 변화를 촉진합니다.

프로토콜

1. 수경재배 시스템

1. 액체 Murashige 및 Skoog(MS) 배지를 준비합니다: 2.165g/L MS 기저염, 10g/L 자당, 0.25g/L 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 및 59mL/L B5 비타민 혼합물, pH 5.75.
2. 매체를 오토클레이브합니다. 멸균 뚜껑이 있는 각 멸균 원통형 유리 또는 투명 플라스틱 탱크(결정화 접시, 100 x 80 mm2)에 18mL를 붓습니다.
   메모: 탱크와 뚜껑을 알루미늄 호일로 싸서 고압멸균하여 사전 멸균합니다.
3. 멸균된 플로우 후드에서 멸균 겸자를 사용하여 10-14일 된 묘목이 있는 각 메쉬 사각형을 반고체 배지에서 수경 원통형 탱크로 부드럽게 옮깁니다(그림 1d). 다공성 수술용 테이프를 사용하여 탱크에 뚜껑을 밀봉합니다.
4. 22-24°C에서 72시간 동안 탱크의 메쉬에서 묘목을 배양하고, 16시간의 광주기와 폭기를 위해 50rpm에서 흔듭니다(그림 1e).
   메모: 이를 통해 식물은 미생물과 접종(공동 재배)하기 전에 수경 재배 환경에 적응할 수 있습니다. 이 대기 기간은 또한 접종 전에 우발적인 미생물 오염이 명백해질 수 있도록 합니다.
   1. 잠복기가 끝나기 전날 다음 단계를 시작합니다.
5. 접종되지 않은 AB 배지를 블랭크로 사용하여 분광 광도계를 사용하여 측정한 바와 같이 배양이 600nm(OD₆₀₀)에서 최종 광학 밀도 1.0에 도달할 때까지 밤새 흔들면서 아그로박테리움(AB) 배지(0.5% w/v 효모 추출물, 0.5% w/v 트립톤, 0.5% w/v 자당, 50mM MgSO₄, pH 7.0)에서 밤새 흔들면서 성장시킵니다.
   메모: OD₆₀₀ 1.0은 약 10⁹ 세포/mL에 해당합니다.
6. A. tumefaciens를 동일한 부피의 0.85% NaCl로 세 번 세척합니다. 같은 양의 멸균 이중 증류수에 재현탁합니다.
7. 접종하기 전에 묘목이 있는 탱크를 주의 깊게 검사하여 오염이 없는지 확인하십시오. 오염되지 않은 탱크의 매체는 깨끗하고 투명해야 합니다.
   1. 탁한 액체(오염)가 있는 탱크를 버리고 나머지 탱크에 번호를 매깁니다. 번호가 매겨진 각 탱크에서 소량(20μL)의 수경 배지를 샘플링하고 Luria 국물(LB)으로 채워진 페트리 접시에 놓습니다. 접시를 28°C에서 배양합니다.
8. 즉시 A. tumefaciens 현탁액 50μL(약 5 x 10⁷ 세포, OD₆₀₀에서 추정)를 번호가 매겨진 각 수경 재배 탱크에 추가합니다. 애기장대 묘목과 A. tumefaciens를 22-24°C에서 16시간의 광주기로 공동 배양하고 50rpm에서 흔듭니다(그림 3f).
   1. 1.7.1단계의 얼룩덜룩한 LB 플레이트를 검사합니다. 탱크의 멸균성을 확인하기 위해 12시간 및 28시간 배양 후. 오염이 있는 경우 추가 다운스트림 분석을 위해 해당 번호가 매겨진 탱크(박테리아 접종)를 사용하지 마십시오.
9. 원하는 경우, 탱크에서 배지 샘플을 제거하고 접종되지 않은 대조군의 배지를 블랭크로 사용하여 분광 광도계를 사용하여 OD₆₀₀을 측정하여 정기적으로 A. tumefaciens의 성장을 모니터링합니다(그림 2).
   메모: 식물 질병 증상은 7일 후에 명백해야 합니다(그림 3).

결과

그림 1: 수경 식물-미생물 공동 재배 시스템. 왼쪽 패널은 수경재배 공동 재배 시스템을 조립하고 운영하는 6가지 주요 단계를 설명하는 순서도를 나타냅니다. 오른쪽 패널은 애기장대-아그로박테리움 상호 작용을 연구할 때 수경 공배 시스템에 대한 실제 실험 재료, 장비 및 운영 절차를 보여줍니다. 이제 식물 또는 박테리아 샘플링을 위한 접종 단계 및 최종 단계가 표시됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
식물 씨앗(Arabidopsis thaliana Col-0)	애기장대 생물 자원 센터	CS7000 시리즈	https://abrc.osu.edu/order-stocks
박테리아(Agrobacterium tumefaciens C58)	워싱턴 대학교	해당 사항 없음
표지된 박테리아	사내		선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름
이중 증류수	(다양한)
마이크로피펫	(다양한)
Murashige 및 Skoog(MS) 기저염	시그마-알드리치	M5524
자당	(다양한)
MES	(다양한)
비타민 B5 믹스	시그마-알드리치	지1019
식물성	(다양한)
깊은 페트리 접시	(다양한)
스테인레스 스틸 메쉬	페리어 와이어 상품 컴퍼니 주식회사	해당 사항 없음	등급: 304; 메쉬 수: 40 × 40; 와이어 직경: 0.01
미세 기공 테이프, 1"	3분	1530-1
주간 성장 챔버	(다양한)
원통형 유리 탱크, 100 × 80 mm	파이렉스	3250	다른 크기를 사용할 수 있으며, 이 경우 액체 함량을 조정해야 할 수 있습니다
플로우 후드	(다양한)
집게	(다양한)
효모 추출물	(다양한)
트립톤	(다양한)
MgSO₄	(다양한)
쉐이킹 인큐베이터	(다양한)