$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 용액 준비
- 10.34g Tris HCl 및 4.17g의 Tris OH를 125mL 플라스크의 dH2O 50mL에 용해시켜 1M Tris-Cl, pH 7.8을 준비합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하고 실온에서 원뿔형 튜브에 보관합니다.
- 125mL 플라스크의 25mL dH2O에 0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 11.98 g 자당 (342.3 g / mol)을 용해시켜 용액 A (20 mM MgCl2, 0.7 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 제조합니다. 500μL 1M Tris-Cl(pH 7.8)을 넣고 부피를 50mL로 조정합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하고 실온에서 원뿔형 튜브에 보관합니다.
- 125mL 플라스크에 0.05g MgCl2(95.2g/mol) 및 13.69g 자당(342.3g/mol)을 25mLdH2O에 용해시켜 용액 B(10mM MgCl2, 0.8M 자당, 10mM Tris-Cl, pH 7.8)를 제조합니다. 500μL 1M Tris-Cl(pH 7.8)을 넣고 부피를 50mL로 조정합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하고 실온에서 원뿔형 튜브에 보관합니다.
- 13.69 g 자당 (342.3 g / mol)을 125 mL 플라스크의 50 mL dH2O에 용해시켜 0.8 M 자당을 준비합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하고 실온에서 원뿔형 튜브에 보관합니다.
- 50mL 플라스크에 0.015g DNase I을 3mL의 dH2O에 용해시켜 5mg/mL 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I)을 준비합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균합니다. 용액을 미세분리기 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
- 0.698g EDTA 이나트륨 탈수물(372.2g/mol)을 125mL 플라스크에 15mL dH2O에 용해시켜 0.125M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), pH 8.0을 제조합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하고 실온에서 원뿔형 튜브에 보관합니다.
- 125mL 플라스크에 0.03g의 세팔렉신 수화물(365.404g/mol)을 50mL의 dH2O에 용해시켜 600μg/mL의 세팔렉신을 준비합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하고 4°C의 원추형 튜브에 보관합니다.
- 50mL 플라스크에 0.015g의 리소자임을 3mL의dH2O에 용해시켜 5mg/mL의 리소자임을 준비합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균합니다. 용액을 미세분리기 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
- 2L 플라스크에 30g의 TSB를 1L의 dH2O에 녹여 3% w/v 트립티카제 대두 국물(TSB)을 준비합니다. 대 장균 스페로플라스트의 제조에 사용할 25mL 또는 100mL TSB가 들어 있는 플라스크에 용액을 분취합니다. 액체 매체를 멸균하기 위한 오토클레이브 플라스크. 멸균 TSB는 실온 또는 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 하룻밤 배양 준비
메모: 적절한 멸균 기술을 사용하여 섹션 2-3을 수행합니다. 원하는 경우 박테리아 균주에는 잠재적인 오염을 줄이기 위해 항생제 내성을 위한 플라스미드가 포함될 수 있습니다. 항생제 내성이 있는 균주를 사용하는 경우 2.1 및 3.1-3.2단계에서 필요한 항생제를 추가합니다.
- 멸균 피펫 팁을 사용하여 단일 박테리아 콜로니를 선택하고 2-3mL의 3% w/v TSB가 들어 있는 14mL 배양 튜브에 넣어 하룻밤 배양을 준비합니다. 37°C에서 배양하면서 16-21시간 동안 흔듭니다.
3. 그람 음성 대장균 스페로플라스의 제조
- 250mL 플라스크에서 하룻밤 배양물을 3% w/v TSB의 25mL 부피에 1:100으로 희석하고 박테리아 용액을 37°C에서 배양하면서 용액이 600nm에서 0.5-0.8의 광학 밀도에 도달할 때까지 약 2.5시간 동안 흔듭니다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정합니다.
- 250mL 플라스크에서, 이 배양물을 30mL의 3% w/v TSB에 1:10으로 희석하고 37°C에서 배양하고, 60μg/mL 세팔렉신(347.4g/mol)의 존재 하에서 2.5시간 동안 흔들어 광학 현미경을 사용하여 1,000배 배율로 관찰할 수 있는 길이가 약 50-150μm인 단일 세포 필라멘트를 생성합니다(그림 1B).
- 박테리아 용액을 1,500 x g, 4°C에서 4분 동안 원심분리하여 필라멘트를 수확합니다. 상청액을 디캔팅하고 버리고 펠릿을 남겨둡니다.
- 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 0.8M 자당 1mL를 부드럽게 첨가하여 필라멘트를 세척합니다. 1분 동안 배양한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버립니다.
- 150μL의 1M Tris-Cl(pH 7.8), 120μL의 5mg/mL 리소자임, 30μL의 5mg/mL DNase I 및 120μL의 0.125M EDTA를 펠릿에 각각의 순서대로 첨가하고 용액을 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 3.5에서 준비된 용액에 1mL의 용액 A를 1분에 걸쳐 점진적으로 첨가하면서 용액을 손으로 부드럽게 소용돌이칩니다. 용액을 실온에서 4분 동안 배양합니다.
- 7mL의 4°C 용액 B를 2개의 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 3.6에서 준비된 용액을 이 두 튜브 각각에 동일한 양의 용액을 첨가합니다. 용액을 1,500 x g, 4°C에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 1-2mL를 제외한 모든 상청액을 조심스럽게 제거합니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. 광학 현미경을 사용하여 1,000X 배율로 샘플을 관찰하여 스페로플라스트 형성을 육안으로 확인합니다(그림 1C).
- 스페로플라스트를 -20°C에서 최대 일주일 동안 또는 3번의 동결-해동 주기를 거칠 때까지 보관합니다.
