그람 양성 박테리아 Bacillus megaterium에서 원형질체 생성

초록

출처: Figueroa, DM, et al. 항균 펩타이드 국소화를 특성화하기 위한 박테리아 스페로플라스트 및 프로토플라스트의 생산 및 시각화. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 그람 양성 박테리아 Bacillus megaterium에서 원형질체를 생성하는 단계별 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 용액 준비

1. 50mL 플라스크에 0.015g의 리소자임을 3mL의_dH2O에 용해시켜 5mg/mL의 리소자임을 준비합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균합니다. 용액을 미세분리기 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
2. 2L 플라스크에 30g의 TSB를 1L의 dH₂O에 녹여 3% w/v 트립티카제 대두 국물(TSB)을 준비합니다. B. megaterium 원형질체의 제조에 사용할 100mL TSB가 들어 있는 플라스크에 용액을 분취합니다. 액체 매체를 멸균하기 위한 오토클레이브 플라스크. 멸균 TSB는 실온 또는 4°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 34.23 g 자당(342.3 g/mol), 0.46 g 말레산(116.07 g/mol) 및 0.38 g MgCl₂(95.21 g/mol)를 250 mL 플라스크의 dH₂O 100 mL에 용해시켜 용액 C(1 M 자당, 0.04 M 말레산염, 0.04 M MgCl₂, pH 6.5)를 제조합니다. pH를 6.5로 조정합니다. 0.2μm 멤브레인이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하고 실온에서 원뿔형 튜브에 보관합니다.
4. 100mL 3% w/v TSB와 100mL 용액 C를 1L 유리병에 혼합하여 200mL 프로토플라스트 배지를 준비합니다. 오토클레이브를 사용하여 용액을 멸균하고 실온에서 보관합니다.

2. 그람 양성 B. megaterium Protoplasts의 제조

1. 250mL 플라스크에서, 하룻밤 배양물을 100mL의 3% w/v TSB에 1:1,000으로 희석하고 박테리아 용액을 37°C에서 배양하면서 용액이 600nm에서 0.9-1.0의 광학 밀도에 도달할 때까지 약 4.5시간 동안 흔든다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정합니다.
2. 액체 배양액을 2개의 50mL 원추형 튜브에 붓고 2,000 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
3. 혈청학적 피펫을 사용하여 양쪽 원뿔형 튜브에서 상청액을 버립니다. 각 펠릿을 2.5mL 프로토플라스트 배지에 재현탁하고 재현탁된 용액을 단일 원추형 튜브에 결합합니다. 결합된 재현탁 용액을 125mL 플라스크에 피펫팅합니다.
4. 5 mg/mL 리소자임 1 mL를 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양하면서 흔든다.
5. 광학 현미경을 사용하여 1,000배 배율 아래에서 원형질체의 성장을 모니터링하고 구체 대신 부풀어 오른 막대로 나타나는 박테리아와 같은 불규칙성을 확인합니다(그림 1). 혈청학적 피펫을 사용하여 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 2,000 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
6. 상층액을 디캔팅하고 펠릿을 5mL 프로토플라스트 배지에 다시 현탁합니다. 프로토플라스트를 -20°C에서 최대 일주일 동안 또는 3번의 동결-해동 주기를 거칠 때까지 보관합니다.

결과

그림 1: B. megaterium의 대표 이미지. (A) B. megaterium 박테리아 및 (B) B. megaterium protoplast. 이미지는 100X 배율로 촬영되었습니다.

재료