장 상피 단층을 가로지르는 대 장균 의 전사이토시스 평가

초록

출처: Islam, A., et al., 신생아 대 장균 균혈증 분리주의 장 경세포증 평가. J. Vis. 경험. (2023년)

이 비디오는 트랜스웰 인서트, 전기 저항 측정 및 박테리아 정량화를 사용하여 장 상피 단층에 걸쳐 신생아 대 장균 의 트랜스사이토시스를 평가하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 세포 접종(실험 시작)

1. 정확히 2시간 후, 쉐이커에서 아침 박테리아 배양액을 제거하고 10분(1,900 x g, 4°C) 동안 원심분리합니다.
   메모: 다음 모든 단계에서 성장을 최소화하기 위해 모든 박테리아 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 항생제가 없는 조직 배양 배지(TCM)에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 0.7-0.9로 조정하고 항생제가 없는 TCM으로 1 x 10⁶ 콜로니 형성 단위(CFU)/mL(약 1:100 희석)의 농도로 추가로 희석합니다. 이 박테리아 현탁액을 사용하여 100μL 부피당 1 x 10⁵ CFU로 각 인서트를 감염시킵니다.
3. 트랜스웰 플레이트에 라벨을 붙이고 각 인서트를 100μL의 OD 조정 접종물(인서트당 총 1 x 10⁵ CFU)으로 감염시킵니다. 이제 분석이 시작되었습니다. 시간을 기록하고 t = 0 h로 기록합니다.
4. 접종 박테리아 현탁액을 플레이트하여 트랙 희석 방법을 사용하여 CFU/mL를 정량화하고 정사각형 LB 한천 플레이트에 10μL 분취량을 도금합니다.

2. 트랜스사이토시스 정량화

1. 접종 후 30분마다 항생제가 없는 TCM 500μL로 새 웰을 채웁니다. 각각의 다른 박테리아 균주에 대해 서로 다른 멸균 겸자 세트를 사용하여 인서트를 이 새로운 웰로 옮깁니다.
2. 각 인서트에 대해 사용된 수집 웰에서 별도의 라벨이 붙은 튜브에 매지를 수집합니다. 이 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 시점 사이에 트랜스웰 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
3. 각 삽입물에 대해 t = 0.5 h, t = 1 h, t = 1.5 h 및 t = 2 h에서 수집된 배지를 결합하고 잠시 소용돌이치게 합니다. 트랙 희석 방법을 사용하여 수집된 배지를 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에 도금하여 실험의 처음 2시간 동안 전세포화된 박테리아의 양을 정량화합니다.
   메모: 30분마다 박테리아를 회수하여 얼음 위에 보관하면 수집 우물에서 박테리아 성장이 최소화되고 주로 트랜스사이토시스 박테리아에 대한 측정이 수행됩니다.
4. 표지된 트랙 희석 LB 한천 플레이트를 보충 CO₂ 없이 37°C의 박테리아 인큐베이터에 넣고 T84 트랜스웰 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 되돌립니다.
5. t = 4 h에서 t = 2.5 h, t = 3 h, t = 3.5 h 및 t = 4 h에서 수집된 배지를 결합하여 2.3단계를 반복합니다.
6. t = 6 h에서 t = 4.5 h, t = 5 h, t = 5.5 h 및 t = 6 h에서 수집된 배지를 결합하여 2.3단계를 반복합니다. 또한, t = 6 h에서 대조군 웰에서 배지를 도금합니다.

3. 실험 종료

1. 실험 종료 시 경상피 전기 저항(TEER)을 측정 및 기록합니다(t = 6시간).
2. 프로브를 70% 에탄올에 10-15분 동안 담가 오염을 제거합니다. 원하는 경우 인서트를 폐기하거나 추가 적용을 위해 저장/처리하십시오. LB 한천 플레이트를 밤새 배양하고 다른 모든 사용된 재료를 소독 및/또는 안전하게 폐기하십시오.
3. 하룻밤 배양 후, 트랙 희석 LB 플레이트에서 박테리아 콜로니를 수동으로 계산하여 접종량과 대장균 트랜스사이토시스의 양을 결정합니다. 컨트롤 플레이트에 박테리아 성장이 나타나지 않는지 확인하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15mL 멸균 원뿔형 튜브	미드사이코	C15B
2 mL 미세 원심분리기 튜브	전위	AVSS2000
50 mL 멸균 폴리프로필렌 원추형 튜브	송골매	352070
원심 분리기	소르발	레전드 RT
일회용 접종 루프	피셔브랜드	22363605
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)	깁코	11965-084
상피 볼트/옴 미터	세계 정밀 기기	에보름
인큐베이터 셰이커	뉴브런즈윅	이노바 4080
인큐베이터	써모 사이언티픽	51030284	이 중 세 가지가 이 방법에 사용됩니다: 하나는 멸균 조직 배양용, 하나는 감염된 조직 배양용, 다른 하나는 박테리아 배양용입니다.
용해 유발 국물	디프코	244610
용해 원수 국물 한천	IBI 사이언티픽	IB49101
분광 광도계	유니코	1100RS
T84 장 세포	미국 조직 배양 컬렉션	CCL248 시리즈
조직 배양 인서트, 폴리에틸렌 트레프탈레이트 멤브레인, 3 μm 기공, 24웰 형식	송골매	353096
조직 배양 플레이트, 24웰	송골매	353504