바이러스 입자 생산을 위한 Borrelia burgdorferi 배양의 준비 및 유도

초록

출처: Eggers, CH 라임병 스피로헤타 보 렐리아 부르크도르페리의 파지 매개 유전자 조작. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 항생제 내성 유전자를 운반하는 휴면 박테리오파지 DNA로 조작된 유전자 변형 보렐리아 부르그도르페리 배양의 준비를 보여줍니다. 항생제 선택 및 배양 후 화학적 유도제는 DNA 손상을 유발하여 내성 유전자를 포함하는 새로운 비리온의 절제, 복제 및 조립을 유도합니다. 두 번째 원심분리 및 재현탁 후, 성숙한 바이러스 입자를 포함하는 박테리아 세포는 다운스트림 적용을 위한 준비가 됩니다.

프로토콜

1. φBB-1 생산을 위한 B. burgdorferi 배양액의 준비

1. 6.6% 열 비활성화 정상 토끼 혈청(BSK)이 보충된 Barbour-Stoenner-Kelly 배지를 준비합니다. 1x BSK 1L의 경우, 표 1 에 나열된 성분을 물 900mL에 결합하고, 1N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.6으로 조절하고, 4°C에서 2-4시간 동안 천천히 혼합한다. 혼합이 완료된 후 pH를 확인하고 필요한 경우 7.6으로 재조정한 후 물과 함께 부피를 1L로 늘립니다. 0.22μM 필터( 재료 표 참조)를 통과하여 배지를 멸균하고 신선하게 사용하거나 4°C에서 ≤2개월 동안 보관합니다.
2. 형질도입 프로토콜을 시작하기 3-5일 전에, 150μL의 적절한 B. burgdorferi 클론(들)을 단단히 뚜껑이 있는 멸균 원추형 원심분리기 튜브의 15mL의 1x BSK에 접종합니다( 재료 표 참조). B. burgdorferi 클론(들) 내에서 이종 DNA의 선택 및 유지를 위해 적절한 농도의 항생제 또는 항생제 조합으로 배지를 보충합니다(표 2).
   참고: B. burgdorferi 는 생물안전 레벨 2 유기체입니다. 이 유기체와 함께 작업하는 동안 모든 적절한 예방 조치를 취하십시오. 인증되고 적절하게 소독된 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 B. burgdorferi 의 살아있는 배양균에 대한 모든 작업을 수행합니다. 질병통제예방센터(CDC) 지침에 따라 B. burgdorferi 및 유기체 자체와 접촉하는 모든 물질을 적절하게 폐기하십시오.
3. 배양물이 ≥5 × 10⁷ 스피로헤타·^mL-1의 밀도에 도달할 때까지 흔들지 않고 33°C에서 배양하며, 이는 약 3-5일이 소요됩니다.

3. B. burgdorferi 파지 φBB-1의 유도

알림: 모든 유리 제품과 플라스틱 제품을 고압멸균하여 멸균하십시오. 0.22μM 필터를 통해 고압멸균 또는 여과하여 모든 용액을 멸균합니다. 아래 단계는 15mL의 부피를 기준으로 제시되었지만 실험의 개별 필요에 따라 더 작거나 더 큰 부피로 확장할 수 있습니다.

1. 파지가 생산될 B . burgdorferi 배양(기증자)의 경우, 2단계에서 두 방법 중 하나로 계산된 농도를 사용하여 4mL의 2 × 10⁸ 스피로헤타·^mL-1을 산출하는 데 필요한 스타터 배양의 부피를 결정합니다. 이렇게 하면 회복 단계에서 15mL에서 5 × 10⁷ 스피로헤타·^mL-1 의 최종 농도가 생성됩니다(아래 단계 3.6).
2. 3.1단계에서 계산된 배양액의 부피를 6,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅하고 펠릿을 신선한 BSK 4mL에 재현탁합니다. 샘플을 최소한의 헤드스페이스로 샘플을 고정할 수 있는 가장 작은 멸균 튜브로 옮깁니다.
3. 4mL의 배양량을 기준으로 권장 농도(표 3)에 적당량의 유도제를 첨가하여 파지 생산을 유도한다. 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 잘 섞습니다.
4. 샘플을 33°C에서 2-4시간 동안 배양합니다.
5. 배양 후 샘플을 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플을 6,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅합니다.
6. 세포 펠릿을 15mL의 1x BSK에 재현탁합니다.

표 1: 형질도입 분석을 위한 B. burgdorferi 클론의 배양 및 선택을 위한 BSK. 여기에 설명된 B. burgdorferi 클론의 고체상 선택을 위한 B. burgdorferi 배양을 위한 1x BSK 및 1.5x BSK의 제형 및 준비는 Samuels를 기반으로 합니다. B. burgdorferi의 성장을 지원하는 BSK(또는 MKP)의 다양한 제형은 아직 형질도입 분석을 사용하여 테스트되지 않았습니다.

구성 요소	1x BSK(배양용)(1L)	1.5x BSK(도금용)(1L)
소 혈청 알부민(분획 V)	35 그램	52.5 그램
10x CMRL-1066(L-글루타민 제외)	8 그램	12 그램
네오펩톤	4 그램	6 그램
효모레이트	1.6 그램	2.4 그램
헴스	4.8 그램	7.2 그램
포도당	4 그램	6 그램
구연산나트륨	0.56 그램	0.84 그램
피루브산나트륨	0.64 그램	0.96 그램
N-아세틸-글루코사민	0.32 그램	0.48 그램
중탄산나트륨	1.76 그램	2.64 그램
열 비활성화 정상 토끼 혈청(INRS)	66 밀리리터	99 밀리리터

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

표 2: B. burgdorferi에서 이종 DNA의 선택 및 유지에 사용되는 잠재적 항생제 및 농도. 이 목록은 Borrelia burgdorferi에서 일반적으로 사용되는 현재 항생제 내성 마커를 기반으로 합니다. 카나마이신, 겐타마이신 및 스트렙토마이신을 물에서 제조하고 0.22μM 필터를 통해 필터 멸균한 후 -20°C에서 보관합니다. 에리스로마이신은 95% 에탄올에서 제조하고 -20°C에서 보관합니다. 많은 실험실에서 200μg·^mL-1의 농도로 선택을 위해 카나마이신을 성공적으로 사용했다고 보고합니다. 형질도입 분석에서 선택을 위해 겐타마이신과 카나마이신을 모두 사용할 때 400μg·^mL-1 카나마이신이 사용됩니다. aadA 유전자는 스트렙토마이신과 스펙티노마이신 모두에 대한 내성을 부여합니다. E에 aadA 유전자를 포함하는 구성체의 선택을 위해. 대장균, 100μg·^mL-1 스펙티노마이신을 사용합니다. 아미노글리코사이드(카나마이신, 겐타마이신 및 스트렙토마이신)는 라임병 치료와 임상적으로 관련이 없습니다. 그러나 에리스로마이신은 특정 상황에서 임상적으로 사용됩니다. B. burgdorferi에서 이 항생제에 대한 자연적인 내성이 보고되었지만, 이 내성 마커는 여기에 보고된 형질도입 분석에서 지금까지 사용되지 않았습니다.

항생제	재고 집중	Bb 배양의 최종 농축
카나마이신	100 mg.mL-1 (물)	200-400μ g.mL-1
겐타마이신	50 mg.mL-1 (물)	50μ g.mL-1
스트렙토마이신	50 mg.mL-1 (물)	50μ g.mL-1
에리스로마이신	2 mg.mL-1 (EtOH에서)	0.06μ g.mL-1

 

 

 

 

 

표 3: B. burgdorferi에서 φBB-1의 유도에 사용되는 잠재적 유도제 및 농도. N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 미토마이신 C 및 에탄올, 메탄올 및 이소프로판올은 모두 B. burgdorferi 균주 CA.11-2A에서 구성 수준 이상의 φBB-1을 유도하는 것으로 입증되었습니다. MNNG는 발암 물질 및 환경 위험이 의심됩니다. 주의해서 사용하고 가연성 용제에 녹인 후 소각하여 폐기하십시오. 미토마이신 C는 발암 물질이 의심되며 잠재적인 환경 위험입니다. 화학 연기 후드 아래에서 주의해서 사용하고 적절하게 폐기하십시오. 발표된 데이터에 따르면 MNNG가 φBB-1을 유도하는 데 가장 효과적인 약제이지만, 이 화학 물질을 사용하는 것의 위험성과 획득의 어려움으로 인해 특히 학생들의 경우 사용이 복잡해집니다. 에탄올을 사용한 유도는 메탄올 또는 이소프로판올보다 일관되게 우수하며 형질도입 분석에서 가장 일반적으로 사용되었습니다.

유도제	스톡 농도(용매)	샘플의 최종 농도
에탄올	100% (없음)	5%
미토마이신 C	2 mg.mL-1 (물)	20μ g.mL-1
1-메틸-3-니트로소-니트로구아니딘(MNNG)	50 mg.mL-1 (DMSO)	10μ g.mL-1

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 L 필터 장치(PES, 0.22 μm 기공 크기)	밀리포어 시그마	S2GPU10RE
12mm x 75mm 튜브(이중 위치 캡)(폴리프로필렌)	미국 사이언티픽	1450-0810	낮은 배이드 부피로 4mL 보유(유도용)
15 mL 원추형 원심분리기 튜브(폴리프로필렌)	미국 사이언티픽	5618-8271
1-메틸-3-니트로소-니트로구아니딘(MNNG)	밀리포어 시그마		주의: 잠재적인 발암 물질; 더 이상 쉽게 구할 수 없으며 제공된 대체품을 테스트하지 않았습니다.
5.75" 파스퇴르 피펫(면 막기/붕규산 유리/비멸균)	써모 피셔 사이언티픽	13-678-8A	사용 전 오토클레이브
50mL 원추형 원심분리기 튜브(폴리프로필렌)	미국 사이언티픽	1500-1211
무수 에탄올
박토 네오펩톤	깁코	DF0119-17-9
박토 TC 이스트톨레이트	깁코	255772
소 혈청 알부민(혈청 대체 등급)	Gemini 바이오 제품	700-104P
CMRL-1066 l-글루타민 없음(분말)	미국 생물학	C5900-01	세포 배양 등급
에리스로마이신	리서치 프로덕츠 인터내셔널 코퍼레이션	E57000-25.0
겐타마이신 시약 용액	깁코	15750-060
포도당(무수 포도당)	써모 피셔 사이언티픽	BP350-500
헴스	써모 피셔 사이언티픽	BP310-500 시리즈
카나마이신 설페이트	써모 피셔 사이언티픽	25389-94-0
Millex-GS(0.22μM 기공 크기)	밀리포어 시그마	SLGSM33SS	여과, 멸균, 항생제 및 기타 소량 용액
미토마이신 C	써모 피셔 사이언티픽	BP25312	주의: 잠재적인 발암 물질; 화학 연기 후드에서만 사용
N-아세틸-D-글루코사민	MP 바이오메디컬스, LLC	100068
페트리 접시 (100mm × 15mm)	써모 피셔 사이언티픽	FB0875712
토끼 혈청 비불임 미량 용혈 새끼(NRS)	펠 프리즈 바이오로제스	31119-3	제조업체의 지침에 따라 열 비활성화
중탄산나트륨	써모 피셔 사이언티픽	BP328-500 시리즈
피루브산나트륨	밀리포어 시그마	P8674-25G
스트렙토마이신 황산염 용액	밀리포어 시그마	S6501-50G
구연산 삼나트륨 이수화물	밀리포어 시그마	S1804-500G	BSK용 구연산나트륨